吳蕭男關靜馬慜悅熊文萍#王洪陽趙翠蘭蘭彭紅梅王秋菊*

1中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學部，國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學研究中心，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點實驗室；聾病防治北京市重點實驗室（北京100853）

2中國人民解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科（北京100853）

聽覺功能障礙及其伴發(fā)的言語交流障礙是重大致殘性疾病之一，其中50%～70%是由遺傳因素引起的遺傳性耳聾[1]，它是父母的遺傳物質(zhì)傳遞給后代所引起的聽力損失。父母一方或雙方可以是耳聾患者，也可以是聽力正常的致病基因攜帶者[2]。其中75%～80%為常染色體隱性遺傳，15%～25%為常染色體顯性遺傳，1%～2%為線粒體或X連鎖遺傳[3]。目前已有150多種基因被證實與人類聽力損失有關（http://www.generaltyhearingloss.org），其中GJB2、SLC26A4和mtDNA12S rRNA是我國耳聾人群中最常見的3種致病基因，且通過大規(guī)模的新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查發(fā)現(xiàn)，2019年報道我國新生兒中GJB2、SLC26A4和mtDNA12S rRNA的突變攜帶率分別為2.30%、2.27%和0.23%[4]。因此，如何有效阻止致聾基因在母親受孕之前的傳遞，實現(xiàn)遺傳性耳聾的源頭一級預防，意義重要。2015年，本課題組與陳子江院士課題組合作通過胚胎植入前遺傳學診斷（Preimplantation Genetic Diagnosis,PGD）完成了我國首例GJB2導致的極重度耳聾阻斷其致病基因傳遞，迎來了一例聽力正常珍貴兒的工作[5]，使有類似需求的家庭前來進行遺傳咨詢。這些攜帶耳聾基因的家庭希望通過PGD技術幫助孕育聽力正常的胎兒[6]。由此，本研究分析了5組夫妻，雙方明確攜帶SLC26A4基因，通過PGD技術幫助其生育聽力正常兒的經(jīng)驗與效果。

1 研究對象

選取2016年1月至2018年12月于我院就診尋求遺傳咨詢與生育指導的5組家庭。夫妻雙方經(jīng)傳統(tǒng)經(jīng)典的Sanger測序耳聾基因檢測均攜帶導致大前庭水管綜合征的SLC26A4基因致病突變（表1）。根據(jù)常染色體隱性遺傳規(guī)律，5組家庭生育大前庭水管綜合征患兒的幾率為25%，生育攜帶者幾率為50%，生育無致病基因攜帶的聽力正常兒的幾率為25%。5組家庭自愿申請希望通過PGD技術，指導生育聽力正常兒。本研究方案已通過我院倫理委員會審批，納入患者均已簽署知情同意書。

家庭1：已育有一名先天性耳聾的患兒：SLC26A4 c.919-2A＞G/c.2168A＞G復合雜合突變及P2RX2 c.610C＞T雜合突變。父方：SLC26A4 c.919-2A＞G雜合突變及P2RX2 c.610C＞T雜合突變，母方：SLC26A4 c.2168A＞G雜合突變。

家庭2：已育有一名先天性耳聾的患兒：SLC26A4 c.919-2A＞G純合突變。父方：SLC26A4 c.919-2A＞G雜合突變，母方：SLC26A4 c.919-2A＞G雜合突變。

家庭3：父方：SLC26A4 c.919-2A＞G/c.1334T＞G復合雜合突變，母方：SLC26A4c.147C＞G雜合突變。

家庭4：已育有一名先天性耳聾的患兒：SLC26A4 c.919-2A＞G純合突變。父方：SLC26A4 c.919-2A＞G雜合突變，母方：SLC26A4 c.919-2A＞G雜合突變。

家庭5：已育有一名先天性耳聾的患兒：SLC26A4 c.1707+5G＞A/c.216C＞T復合雜合突變。父方：SLC26A4 c.1707+5G＞A雜合突變，母方：SLC26A4 c.216C＞T雜合突變。

2 研究方法

2.1 納入遺傳性耳聾PGD臨床流程

所有擬作PDG的家庭簽署知情同意書，由耳鼻咽喉科醫(yī)師進行耳聾遺傳咨詢獲得家系成員遺傳信息，再經(jīng)Sanger測序進行耳聾基因檢測確定致聾基因。輔助生殖中心對夫妻雙方進行輔助生殖前相關檢查，包括夫妻雙方染色體的核型分析、血常規(guī)、血生化、肝腎功能、血型、凝血四項，病毒五項；父方禁欲3-7天的精子形態(tài)和功能分析（至少2次）；母方常規(guī)婦科檢查、宮頸細胞學檢查、宮腔鏡檢查、經(jīng)期第2-4天性激素水平檢測、卵巢、甲狀腺和乳腺超聲檢查等。

2.2 基因位點突變信息家系驗證

采集家系成員外周血與口腔黏膜細胞，經(jīng)單細胞全基因組擴增（Multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）與高通量測序技術，將家系gDNA與NCBI參考序列比較，進一步驗證基因突變位點。

2.3 促排卵胚胎體外受精、培養(yǎng)

采用我院輔助生殖中心的常規(guī)方法進行控制性促排卵，體外精子與卵子受精發(fā)育成囊胚。

2.4 囊胚活檢及遺傳學診斷

抽取囊胚期滋養(yǎng)外胚層，運用MALBAC技術對囊胚細胞的遺傳物質(zhì)進行擴增，高通量測序檢測目標區(qū)域是否攜帶耳聾基因—基因突變位點檢測，用SNP分型技術分析基因突變位點連鎖，驗證突變位點的檢測結果，并對滋養(yǎng)外胚層進行染色體非整倍體檢測和10M以上片段重復或缺失情況檢測，將活檢后的囊胚采用玻璃化冷凍方法保存。

2.5 胚胎移植及臨床妊娠確認

根據(jù)遺傳學檢測的結果，選取非致病基因型的囊胚進行子宮植入。胚胎移植后14天檢測母方血人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG），5-6周B超檢測孕囊及胎心搏動可確定為臨床妊娠。孕期嚴格產(chǎn)檢至18-20周。

2.6 羊水穿刺診斷及出生后聽力篩查

在孕18-20周時羊膜腔穿刺取羊水用于產(chǎn)前基因遺傳診斷檢測(具體方法同2.4)，進一步判斷胎兒的基因型，明確為非致病性基因型，告知孕婦檢測情況。正常分娩后，進行新生兒出生后的聽力篩查。

3 結果

3.1 基因位點突變信息驗證結果

5組家庭的夫妻雙方經(jīng)單細胞全基因組擴增與高通量測序技術，家系gDNA與NCBI參考序列比較，明確其基因突變位點與Sanger測序耳聾基因檢測結果一致，可以進入PGD周期。

3.2 PGD結果

5組家庭PGD及囊胚數(shù)量、基因檢測情況、胚胎選擇情況、妊娠檢測結果，最后分娩結果等請見表1。

表1 攜帶SLC26A4基因突變的5組家庭遺傳咨詢及PGD情況Table 1 Genetic counseling and PGD status in 5 families with SLC26A4 gene mutations

在上述過程中，有如下情況需要表明：

家庭1：第一次PGD進行兩個基因的位點突變及連鎖SNP分析時，SLC26A4基因SNP區(qū)域在單細胞擴增時效果較差，SNP數(shù)據(jù)量極少，胚胎攜帶突變位點情況根據(jù)目前僅有的位點無法進行等位基因脫扣的判斷，存在一定風險。因此，不具備可選用囊胚移植機會。夫妻雙方同意選擇進行第2次PGD周期。

家庭3：第一次PGD培育出17個囊胚，其中有6個囊胚染色體形態(tài)數(shù)目正常。在這6個囊胚中有5個囊胚為復合雜合突變，1個囊胚為單雜合突變，與家庭3溝通后決定放棄移植。后該家庭選擇自然受孕，并于受孕18周后進行羊水穿刺診斷，提示胎兒僅獲得了父親一人攜帶的耳聾突變基因，為單雜合突變（SLC26A4 c.919-2A＞G）。由于SLC26A4突變基因所致耳聾為常染色體隱性遺傳，因此排除了胎兒由于SLC26A4基因突變所致聾的可能性。

家庭4：第二次PGD培育出13個囊胚，其中有8個囊胚染色體形態(tài)數(shù)目正常。在這8個囊胚中有1個囊胚為純合突變，7個囊胚為單雜合突變。判斷如果移植單雜合突變的囊胚，子代僅為耳聾基因攜帶者，不會因SLC26A4突變基因而罹患遺傳性耳聾。與家庭4反復討論，并告知其結果后，該家庭同意移植單雜合突變的2號胚胎。

家庭5：研究時未記錄父方年齡，母方在第一次促排卵胚胎體外受精、培養(yǎng)過程中未能成功排卵，導致未能獲取受精卵，后退出研究。父方年齡遂未知。

4 討論

本研究針對臨床聾病遺傳咨詢中5組夫妻雙方均攜帶SLC26A4致聾基因的家庭，進行了PGD輔助生殖工作。在5組家庭中，有2組家庭（家庭1、家庭2）通過PGD成功受孕，并生育出聽力健康兒；1組家庭（家庭3）選擇自然受孕，并通過羊水穿刺明確子代僅攜帶耳聾基因，生育了聽力健康兒；1組家庭（家庭4）仍在妊娠期，待日后隨訪進行羊水穿刺檢查；1組家庭（家庭5）由于促排卵未能成功而退出研究。本研究中的5組家庭有4組家庭由于已經(jīng)生育了一個大前庭水管綜合證的患兒，迫切希望通過PGD在懷孕前即可了解植入胚胎耳聾基因攜帶狀況，由此選擇的PGD技術幫助他們生育未攜帶致病基因的胎兒，以避免遺傳基因的代代傳遞。本臨床研究中發(fā)現(xiàn)由于個體差異的存在，母親身體狀況不同，常規(guī)促排卵方案進行后排出的卵細胞數(shù)目不同，質(zhì)量不同，存在由于獲取的卵細胞數(shù)目較少而導致在一次PGD過程中不能找到合適的囊胚，從而無法植入胚胎的情況，也是本研究中的家庭1、2、4均進行第二次PGD及家庭3、5第一次PGD未能成功的原因。

因此，在遺傳性耳聾中應用PGD技術是一個系統(tǒng)工作，需要多學科協(xié)作，更需要家庭的充分信任和積極配合，最后方可選擇到未受致病基因影響的胚胎。

本研究中的家庭5，母方年齡39歲，超過了PGD建議年齡35歲之前為較佳年齡，常規(guī)促排卵方案未能成功排卵。隨著母方年齡的增加，卵巢儲備逐漸下降、對外源性促性腺激素的反應能力下降、獲卵數(shù)目減少、卵母細胞質(zhì)量(如非整倍體、染色體異常等)下降、優(yōu)質(zhì)胚胎率下降、胚胎著床率及妊娠率下降，流產(chǎn)率增加。因此母方年齡被認為是影響妊娠率的主要因素，間接影響PGD的成功[7,8]。

家庭1、家庭2結果的成功，得益于遺傳學診斷方面的實驗技術的發(fā)展。通過對胚胎進行非整倍體檢測和致病基因位點檢測雙重檢測相結合的遺傳學診斷手段，能夠避免PGD過程中選擇非整倍體胚胎移植而導致流產(chǎn)，增加生育正常子代的成功率[9]；而為了避免因擴增失敗、優(yōu)勢擴增、等位基因脫扣、樣本污染等可能因素導致的誤診，我們在進行基因突變位點檢測同時進行了SNP分型技術分析基因突變位點連鎖，增加診斷結果的準確性[10,11]，這也是我們對家庭1進行第二次PGD的原因。在胚胎活檢方面，由于卵母細胞減數(shù)分裂產(chǎn)生的極體進行活檢僅能代表母方的遺傳信息，而卵裂期囊胚活檢發(fā)生嵌合的概率又高達60%，活檢對嵌合現(xiàn)象的檢測準確性低等，容易產(chǎn)生誤診。因此在本研究中，均選擇吸取滋養(yǎng)外胚層進行活檢，不僅能夠改進上述的不足（雖然囊胚期胚胎的嵌合率較低，但仍存在由嵌合導致的誤差）[12,13]，并且在胚胎活檢診斷率與胚胎種植率上均有提高。滋養(yǎng)外胚層活檢已成為越來越多PGD選擇的活檢方式[14,15]。

1990年，國際上首例由PGD技術誕生了第一名健康女嬰以來，直至今日，PGD已經(jīng)可以用于避免包括β-地中海貧血(beta-thalassemia)、囊性纖維化（cystic fibrosis）、亨廷頓舞蹈病(Huntington disease)在內(nèi)的超過200種單基因遺傳病的垂直傳遞[16]。而高通量測序技術的快速發(fā)展，通過將與疾病有關的序列制成特異性探針進行測序，將測序后的序列信息與人類基因組數(shù)據(jù)庫序列進行對比，能夠準確發(fā)現(xiàn)致病突變，取代了第一代測序技術通量低、檢測周期長、成本高的缺點[17,18]，進一步促進了PGD技術在阻斷遺傳性耳聾致聾基因垂直傳遞中的應用。對于PGD用于阻斷SLC26A4耳聾基因的案例，則最早由臺灣的吳振吉教授等于2010年報道[19]。

本研究的5例PGD技術用于SLC26A4基因突變致聾家庭的案例，進一步豐富了PGD技術在遺傳性耳聾應用的臨床經(jīng)驗，為遺傳性耳聾PGD臨床流程的建立提供理論支持。綜上，PGD能夠在基因水平預防單基因遺傳病的垂直傳遞，是遺傳性耳聾家庭選擇的一種重要的優(yōu)生方式。