胡渝曜 梁東 王晶 劉軍?

1)(中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機械研究所,強場激光物理國家重點實驗室,上海 201800)

2)(中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

搭建了一種基于電動可調(diào)焦透鏡(electrically tunable lens)的大范圍快速光片熒光顯微成像系統(tǒng).通過引入電動可調(diào)焦透鏡與一維振鏡以實現(xiàn)成像物平面和光片位置的快速移動,再結(jié)合高速sCMOS完成快速光片熒光顯微成像.另外實驗中通過改善光路與提升動態(tài)成像質(zhì)量,實現(xiàn)了大范圍掃描并減少了偽像.最終對成像性能進行測試,本系統(tǒng)的縱向分辨率和橫向分辨率分別達到約5.5 μm和約0.7 μm,單幅圖像穩(wěn)定成像的速度約為275 frames/s,成像深度可超過138 μm,能滿足對具有一定尺寸的生物樣本進行實時清晰成像的需求.

1 引 言

熒光顯微成像技術(shù)通過利用熒光分子對活體生物進行標記實現(xiàn)特異性成像,由于斯托克斯平移的特性,有著較高的信噪比,在醫(yī)學(xué)生物研究等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1-3].

自1903年,Siedentopf和Zsigmondy提出光片照明技術(shù)之后,到2004年,Huisken等[4]才將光片熒光顯微成像技術(shù)(light-sheet fluorescence microscopy,LSFM)應(yīng)用到生物細胞探測中,然而由于傳統(tǒng)的光片熒光顯微成像技術(shù)是長時間對生物體的同一個平面成像,不僅有相對較高的光漂白和光毒性,而且無法捕捉到生物體的三維信息.2009年,Huisken和Stainier[5]首次提出了三維掃描的想法,采用平移樣品的方式實現(xiàn)了三維掃描.但是,在實驗中無論是平移或者旋轉(zhuǎn)樣品[6],不僅會影響樣品其本身的穩(wěn)定性,同時也會限制成像速度.為了避免樣本的振動,近年有報道提出利用移動探測物鏡的方式實現(xiàn)三維掃描成像[7-9].這種方式雖然保證了樣品的穩(wěn)定性,但是由于探測物鏡的質(zhì)量,其慣性限制了這種方法的速度,并且隨著相機速度越快,這種限制的影響將越凸顯.

為了避免振動和提高成像速度,有一種策略是通過分幅高速攝影的方式[10]實現(xiàn)快速成像,與這種方式類似的還有裁剪像素的方案[11],它們節(jié)省了不必要的信息獲取和讀取時間,且針對于觀測某一視場范圍內(nèi)的樣本,能夠有效地提高成像速度和信噪比.但整個系統(tǒng)成像速度的限制因素不僅僅源自相機.光路的控制速度也十分重要,為了突破移動探測物鏡或移動樣本等方案的速度極限,本文研究引入電動可變焦距透鏡(electrically tunable lens,ETL)置于探測物鏡后方,通過改變焦距以實現(xiàn)控制成像物平面的快速移動;再采用高速科學(xué)相機sCMOS進行探測;加以配合LABVIEW編程完成自動化控制,使振鏡、ETL和相機達到實時同步且相互協(xié)調(diào),有效減少了快速成像中產(chǎn)生的偽像.另外,為了突破更大的成像深度,還引入新的透鏡改善光路,并最終實現(xiàn)了大掃描范圍的穩(wěn)定快速光片顯微成像.

2 理論分析

2.1 光片產(chǎn)生的理論計算

光片的產(chǎn)生,是由于通過柱透鏡的光束,隨著光束的傳播,其光束一個維度維持不變,但在另一個與之垂直的維度上會逐漸被聚焦壓縮,從而能夠形成非常薄的片狀光束.具體如圖1所示

圖1 柱透鏡產(chǎn)生光片示意圖Fig.1.Schematic diagram of the cylindrical lens.

光片實際上是在傳播光路上形成一薄的片狀光束,且其光束強度符合高斯分布,在橫向電場分布上也滿足高斯函數(shù)分布,其電場復(fù)振幅為

其中r為場內(nèi)任一點距離光軸中心的徑向距離,x為光軸上的位置坐標,ωo為x=0時的光斑半徑,i為虛數(shù)單位,k為波數(shù),R(x)是在x點處波陣面的曲率半徑,?(x)是 與x有關(guān)的相位因子.ω(x)為在x點處的光斑半徑.因此在x處的光束半徑為[12]

其中 λ 為激發(fā)光的波長,此時可以認為是光片最薄位置處的厚度,即高斯光束的束腰半徑,當(dāng)高斯光束的光斑半徑為束腰處半徑的倍時,該兩處之間的距離為瑞利長度 xR[13]

其中 ωo為束腰半徑,xR的大小決定了成像視場的大小.因此在實驗中可根據(jù)實際需求在光片厚度和瑞利長度之間做出折中選擇.

2.2 整體成像光路分析

圖2為本實驗設(shè)計的快速光片顯微成像系統(tǒng)光路原理圖.其整體上可分為照明和探測兩個部分.其中照明部分的光束傳播過程與功能可以描述為由激光器發(fā)出的高斯光束經(jīng)擴束后再通過柱透鏡聚焦產(chǎn)生片狀光,在柱透鏡的焦點處放置一維掃描透鏡,控制片狀光出射的不同角度,同時在后方放置透鏡3和透鏡4組成4f系統(tǒng),將片狀光中繼至激發(fā)物鏡,再由物鏡壓縮成光片照明到樣品上,進而實現(xiàn)對樣品不同位置照明的控制.

圖2 快速光片顯微成像系統(tǒng)光路圖Fig.2.Schematic diagram of rapid light-sheet fluorescence microscopy imaging system.

激發(fā)樣品產(chǎn)生的熒光由與激發(fā)光路垂直的探測部分接收,激發(fā)的熒光經(jīng)窄帶濾波片濾除非熒光波段后,通過控制ETL的焦距,再與鏡筒透鏡、透鏡5和透鏡6共同作用,將熒光光束聚焦至sCMOS的陣列面,從而實現(xiàn)完整的成像過程.

2.3 電動可調(diào)焦透鏡分析

本文選用的是Optotune公司型號為EL-10-30-Ci的液態(tài)透鏡,其最大的特點是避免了成像過程中機械的振動,也因此能夠獲得更高的響應(yīng)速度,圖3由Optotune公司提供,是關(guān)于該ETL在全量程內(nèi)變化的響應(yīng)時間曲線.

對于大階躍信號的響應(yīng),透鏡變化焦距并達到穩(wěn)定時需要約4—8 ms的響應(yīng)時間,在快速成像過程中這段時間是不可忽略的,處理不當(dāng)會導(dǎo)致偽像.而實驗中我們研究測試,當(dāng)以小階躍信號驅(qū)動時其響應(yīng)時間僅約2 ms,這一發(fā)現(xiàn)有助于提高系統(tǒng)整體的成像速度.再借助LABVIEW并行運算的優(yōu)勢,保證穩(wěn)定成像的前提下,能夠?qū)TL與掃描振鏡的總響應(yīng)時間壓縮在約500 Hz的速度.

圖3 EL-10-30-C對電流階躍的典型光學(xué)響應(yīng)Fig.3.Typical optical response of the EL-10-30-Ci to a current step.

2.4 大掃描范圍成像分析

實驗中在對一些一定尺寸的活體生物,如幼年斑馬魚心臟(100—150 μm)等,進行三維成像時[14,15],往往需要較大的縱向成像深度,同時要求滿足快速的實時成像,因此選取了型號為EL-10-30-Ci的電動可調(diào)焦透鏡[16].在屈光度較小時,其能夠保持較好的波前質(zhì)量.為了減少像差的產(chǎn)生,ETL自身可調(diào)節(jié)的屈光度不宜過大,但這又將限制三維成像的縱向深度,難以滿足較大體積生物的成像.

通過實驗研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)ETL自身的屈光范圍不變時,光束進入ETL的孔徑角越小,其在光軸上可調(diào)焦的范圍l越大,反之,則越小.這為擴大掃描范圍提供了思路.原理如圖4所示

圖4中紅色實線光束代表當(dāng)ETL處于最大焦距f1時的光束傳播路徑,藍色虛線光束代表ETL處于最小焦距f2時的光束傳播路徑,此時光束入射的孔徑角θ、出射光束的像點 l' 有如下關(guān)系:

利用高斯公式追跡不同光束與光軸相交的位置即物點 lp,可得

聯(lián)立(4)式和(5)式,能夠得出 l2＜l1,即入射光束孔徑角越小則可調(diào)焦范圍越大.同時根據(jù)光線追跡進一步的數(shù)值分析發(fā)現(xiàn),掃描范圍與探測光路上距離物方的第奇數(shù)個透鏡焦距的平方成正比,與距離物方的第偶數(shù)個透鏡的焦距平方成反比.

圖4 光束以不同孔徑角透過ETL(a)以小孔徑角入射ETL;(b)以大孔徑角入射ETLFig.4.The beam passing through the ETL at different aperture angles:(a)The beam passing through the ETL at small aperture angles;(b)the beam passing through the ETL at big aperture angles.

在本實驗光路中,為了實現(xiàn)更小的入射孔徑角,一種比較直接的方案是可以改變鏡筒透鏡的焦距,但除了掃描范圍,同時還需要考慮ETL口徑對光束的遮攔現(xiàn)象.參考圖5(a).

通過實驗研究分析,為了避免圖5(a)中的孔徑遮攔,實現(xiàn)圖5(b)的結(jié)果,我們選擇引入透鏡Lens 5壓縮光束,將其置于ETL與鏡筒透鏡之間并與鏡筒透鏡共軛(圖2),該透鏡的焦距 fL1應(yīng)滿足如下關(guān)系式[17]:

其中fr為透鏡Lens 5的焦距,dETL為ETL的孔徑大小,dBFP為顯微物鏡后焦平面的孔徑大小,一般約等于后孔徑尺寸.在滿足(6)式的情況下,實驗中若透鏡焦距越小,則可實現(xiàn)越大的掃描范圍.但為了保證較好的波前質(zhì)量,fr依然不能過小.實驗中根據(jù)掃描振鏡的轉(zhuǎn)動角度 Δ θ,結(jié)合激發(fā)光路中Lens 4的焦距 fL4及 激發(fā)物鏡的放大倍率 Meo,能夠找出振鏡的轉(zhuǎn)動角度與受振鏡控制的光片位移量之間存在的關(guān)系,進而推算出光片在樣品池中的位移量 Δ δ,由圖2有

圖5 光束穿過ETL孔徑(a)ETL孔徑阻擋光束;(b)ETL孔徑未阻擋光束Fig.5.The beam passing through the ETL:(a)The beam is blocked by the aperture of ETL;(b)the beam is unblocked by the aperture of ETL.

以(7)式為基礎(chǔ),根據(jù)Thorlabs公司提供的手冊可得振鏡驅(qū)動電壓與轉(zhuǎn)角的關(guān)系,再結(jié)合測出的振鏡驅(qū)動電壓即能得到轉(zhuǎn)角 Δ θ,進而獲得光片位移量 Δ δ,即縱向成像深度.經(jīng)測量結(jié)果顯示,當(dāng)Lens 5焦距為75 mm時實驗測量出清晰成像的縱向深度可達約138 μm,這超過了最近報道[15]在采取了ETL的光片顯微成像中實現(xiàn)的20 μm成像深度.綜上,設(shè)法縮小ETL的入射光束孔徑角能夠有效地擴大縱向成像深度,本文基于這一思路提出的方案推動了光片顯微成像在較大尺寸樣本中探測的研究進展.

3 實驗結(jié)果

3.1 系統(tǒng)的成像分辨率

3.1.1 系統(tǒng)橫向分辨率測量

系統(tǒng)的橫向分辨率包括由瑞利判據(jù)定義的光學(xué)分辨率與探測器像素尺寸等因素決定的儀器分辨率.在本實驗中,光學(xué)分辨率起到了主要的限制作用.通過瑞利準則公式其中NA為探測物鏡數(shù)值孔徑,λf為樣品產(chǎn)生的熒光波長.可得系統(tǒng)理論上能分辨的最小橫向尺寸約為652 nm.

再由瑞利判據(jù)定義,在成像光學(xué)系統(tǒng)中,分辨本領(lǐng)是衡量分開相鄰兩個“物點”的像的能力.為了減小物體尺寸對實驗結(jié)果的影響,我們選取尺寸小于系統(tǒng)理論橫向分辨率,直徑約為100 nm的熒光微球作為“物點”.通過測量其像斑的能量分辨率進而獲得系統(tǒng)實際的橫向分辨率.

由于熒光強度與激發(fā)光強成正比,再根據(jù)光片強度又近似為高斯分布的特性,可知當(dāng)熒光微球的光強值最大時,熒光微球最接近光片的中心.基于此原理,首先對圖像做去卷積處理以減少背景噪聲,再采用灰度特征搜索算法找出圖像中灰度值最大,即最靠近光片中心的5個熒光微球,在圖6左側(cè)圖像中框選并分離出來,分別如圖6(b)—圖6(f)所示.圖6(g)—圖6(k)顯示的分別為經(jīng)過圖6(b)—圖6(f)中不同熒光微球中心的水平線的灰度剖面線,橫坐標為寬度/μm,縱坐標為灰度值強度.為了減少偶然誤差,將圖6(b)—圖6(f)的5個灰度剖面線的數(shù)據(jù)進行歸一化后再做平均化處理,從而得到圖6(l)顯示的曲線分布.根據(jù)光束的高斯分布特性,再對圖6(l)的數(shù)據(jù)求高斯擬合曲線,結(jié)果如圖7所示

此時圖7中擬合曲線的半高全寬值(full width at half maximum,FWHM)即為上述提及的能量分辨率,而系統(tǒng)在圖像中能分辨的最小尺寸可由能量分辨率近似表征[17-20].因此,可得系統(tǒng)的橫向分辨率 Rlateral約為0.73 μm.導(dǎo)致其與理論計算結(jié)果不同的因素有多方面,主要由實驗中視0.1 μm熒光微球為“物點”引入的誤差與探測器像元尺寸影響的測量精度共同決定.

3.1.2 系統(tǒng)縱向分辨率測量

系統(tǒng)的縱向分辨率主要由光片厚度和振鏡控制光片在縱向的最小位移量決定.在本實驗中,振鏡的性能與光路的設(shè)計保證了光片的最小位移量小于光片厚度.因此可將光片的厚度視為限制系統(tǒng)的縱向分辨率的主要因素.

實驗中選取反射鏡替代樣品置于樣品池中(圖8(a)),并使鏡面與激發(fā)光路的光軸和探測光路的光軸均成45°,實現(xiàn)光片輪廓在CMOS成像面上的垂直投影,光路示意如圖8(b)所示.接著再利用與3.1.1節(jié)中類似的方法,首先畫出均勻分布的5條經(jīng)過圖8(b)中豎直光片的水平線的灰度剖面線,然后將這些數(shù)據(jù)進行歸一化和平均化處理以減少偶然誤差,結(jié)果如圖8(c)所示,最終通過計算平均后的曲線的FWHM值,完成光片實際厚度的近似測量[21].

圖6 100 nm熒光微球的分析(a)100 nm熒光微球的拍攝圖像;(b)-(f)5個光強最大的熒光小球;(g)-(k)分別是(b)-(f)中熒光小球的灰度剖面線;(l)(g)-(k)的歸一化并平均化之后的曲線Fig.6.Analysis of 100 nm fluorescent spheres:(a)Image of 100 nm fluorescent spheres;(b)-(f)five fluorescent spheres with the largest intensity;(g)-(k)intensity profile of a horizontal line passing through the center of fluorescent sphere in(b)-(f);(l)the normalized and averaged curves of(g)-(k).

圖7 高斯擬合曲線Fig.7.Gaussian fitting curve.

圖8(c)中的縱坐標為灰度值強度,橫坐標表示寬度,單位為μm.根據(jù)實驗結(jié)果描繪的曲線,可計算出曲線的FWHM值約為5.5 μm,這表示光片的厚度約為5.5 μm,即縱向分辨率約為5.5 μm.

3.2 動態(tài)成像特性分析與優(yōu)化

動態(tài)成像特性主要包括成像過程中離焦、圖像的偏移和放大率的變化等現(xiàn)象.

3.2.1 圖像離焦的校準

為了確保清晰成像,在動態(tài)成像過程中,需使光片與成像物平面保持實時重合,否則會因離焦導(dǎo)致圖像模糊.為了提高信號光強度且有利于測量,選取光強最強的光片中心作為理想的成像物平面,當(dāng)成像物平面與光片中心重合時視為成像物平面與光片達到了最佳重合度.基于此,采取固定物平面,以最小步進移動光片,同時將靜止的熒光微球作為探測目標的方式,尋找最佳重合面.根據(jù)熒光強度與激發(fā)光強成正比的特性,將當(dāng)熒光微球的光強最強且光斑尺寸最小時的圖像作為離焦程度最小、最接近光片中心的最佳重合度圖像.如圖9所示.

圖8 光片不同橫截面的熒光光強分布(a)記錄光片輪廓的光路;(b)光片輪廓圖;(c)灰度剖面線平均化后的曲線Fig.8.Fluorescence intensity distribution at different profile of the light sheet:(a)Optical path for recording light sheet;(b)profile of light sheet;(c)average curves of intensity profile of light sheet.

圖9 同一個熒光小球在光片不同位置時的圖像Fig.9.Image of the same fluorescent sphere at different positions of the light sheet.

對圖9中5幅圖像的熒光小球進行灰度測量,結(jié)果顯示圖9(c)中熒光小球的灰度值最大,表征此時成像物平面與光片重合度最佳,即此時的圖像清晰度最高.

3.2.2 圖像偏移及放大率變化的校準

在調(diào)校ETL以保證其在變焦過程中圖像的穩(wěn)定[22]之前,須檢測出ETL在不同驅(qū)動電流值下的圖像偏移及放大率的變化量,并將其作為光路調(diào)校的反饋信息.在ETL電流區(qū)間的最小值、半峰值以及峰值處分別對周期為200 μm的光柵網(wǎng)格進行成像,結(jié)果如圖10所示.

實驗中ETL設(shè)定的安全驅(qū)動電流區(qū)間為0—292 mA,當(dāng)驅(qū)動電流分別為0,146和292 mA時,此時對應(yīng)的相對縱向深度分別為0,69和138 μm.在不同位置處的周期性光柵圖像之間可能會存在偏移或放大率的變化.為了定量檢驗圖像偏移及放大率的變化量.采用霍夫變換直線檢測算法找出200 μm光柵的黑色邊沿并量化檢測點的具體坐標,在圖中以紅色點標記.然后通過計算不同圖像的檢測點之間的距離變化量作為圖像放大率的變化量ΔM,具體為

式中(xin,yjm)為第i張圖像中選取的第n個檢測點的橫坐標和第j張圖像中選取的第m個檢測點的縱坐標,而 Δ Mh與 Δ Mv分別表示沿水平方向和垂直方向的放大率變化量,Si則表示第i張圖像中所選兩個檢測點之間的直線距離.

圖10 在ETL的范圍內(nèi)對200 μm網(wǎng)格成像(a)IETL=0 mA時的圖像;(b)IETL=146 mA時的圖像;(c)IETL=292 mA時的圖像Fig.10.Images of a 200 μm grid over the ETL scan range:(a)Image when IETL=0 mA;(b)image when IETL=146 mA;(c)image when IETL=292 mA.

對于圖像偏移量 Δ D 的具體值,通過測量不同圖像中選定檢測點坐標的自身位移量獲得,并將其位移量作為反饋信息,微調(diào)光路最終達到校準的效果.具體計算為

根據(jù)(8)式和(9)式,計算得出系統(tǒng)在整個掃描范圍內(nèi)的放大率變化量約為3.69%,圖像偏移量約為4.1%.基本實現(xiàn)在ETL的全范圍掃描過程中,保證了較小的圖像放大率變化和圖像偏移.

3.2.3 圖像偽影分析與校準

在已有的一些報道實驗結(jié)果中尚存在偽影圖像[17],主要體現(xiàn)在熒光小球像斑的拉長.我們對此進行研究,建立了偽像評價方案,首先,通過提取動態(tài)掃描成像過程中連續(xù)時間拍攝的圖像,再采取3.1.1節(jié)類似方法,顯示出掃描過程中同一個熒光小球的灰度剖面線變化情況,進而求取其半高全寬值并將數(shù)據(jù)進行對比.相較于偽影較少的圖,發(fā)現(xiàn)偽影明顯的圖中其灰度剖面線的半高全寬值明顯更大,且光強不符合高斯分布.在掃描成像過程中[11,15,17],若忽略了ETL和掃描振鏡到達穩(wěn)態(tài)所需要的時間,ETL與振鏡在相機曝光期間進行的動態(tài)變化可能會導(dǎo)致偽像的產(chǎn)生.因此為了避免偽像,須保證系統(tǒng)在每次成像時均處于穩(wěn)定狀態(tài),這需要在編程中考慮到ETL、振鏡的響應(yīng)時間、相機的曝光時間以及它們時序的控制.為了驗證本成像系統(tǒng)在消除偽像方面的性能,在實驗中選取三幅連續(xù)時間的同一熒光小球圖像,并求取其半高全寬值,結(jié)果如圖11所示.

圖11(a)—圖11(c)分別為同一熒光小球在三維掃描過程中,連續(xù)時間的三幅成像結(jié)果,畫出其經(jīng)過熒光小球中心的灰度剖面圖,通過計算其半高全寬值并相互對比,可以發(fā)現(xiàn)雖然曲線的強度峰值變化,但其半高全寬值變化率約為8%,有效地控制了偽像的產(chǎn)生.由此可以看出,在動態(tài)成像中保證曝光期間系統(tǒng)的穩(wěn)定,能夠有效減少在快速光片顯微成像中產(chǎn)生的偽像,實現(xiàn)清晰的動態(tài)成像.

3.3 系統(tǒng)的成像速度

影響系統(tǒng)成像速度主要因素包括: ETL響應(yīng)時間、振鏡響應(yīng)時間、相機曝光時間、相機的圖像讀出時間、圖像存儲時間、程序本身的運行時間.實驗中將對各個因素進行分析與優(yōu)化,以實現(xiàn)更快的成像速度.

首先采用濱松公司型號為C11440的高速sCMOS,通過縮短相機曝光時間,選擇感興趣的區(qū)域縮小成像范圍,達到減少圖像讀出時間與存儲時間的目的,實現(xiàn)以超過500幀/s速度拍攝512 × 512像素的圖像.其次結(jié)合Labview的并行運算優(yōu)勢,在系統(tǒng)穩(wěn)定成像的前提下,將ETL與振鏡的小階躍信號總響應(yīng)時間壓縮至約500 Hz.最終實現(xiàn)系統(tǒng)中各個器件之間的相互協(xié)調(diào),完成穩(wěn)定的快速清晰成像(補充材料video 1).對于成像速度的檢測,采取在程序循環(huán)周期初始位置植入計時功能的方式,記錄系統(tǒng)在ETL、振鏡與相機共同協(xié)調(diào)工作以及程序運行一個周期耗費的總時長,從而得到整個系統(tǒng)在穩(wěn)定成像時的成像速度約為275幀/s.

圖11 本實驗結(jié)果的偽像分析(a)0 ms時經(jīng)過熒光小球中心的灰度剖面線;(b)3.7 ms時經(jīng)過熒光小球中心的灰度剖面線;(c)7.4 ms時經(jīng)過熒光小球中心的灰度剖面線Fig.11.The artifacts analysis of the experimental results:(a)Intensity profile of a line passing through the center of fluorescent sphere captured at 0 ms;(b)intensity profile of a line passing through the center of fluorescent sphere captured at 3.7 ms;(c)intensity profile of a line passing through the center of fluorescent sphere captured at 7.4 ms.

4 結(jié) 論

搭建了一套基于電動可調(diào)焦透鏡的大范圍快速光片顯微成像系統(tǒng),通過引入電動可調(diào)焦透鏡、一維電控反射振鏡系統(tǒng),結(jié)合Labview與高速sCMOS實現(xiàn)快速光片顯微成像.另外通過實驗分析與研究,有效減少了快速成像中產(chǎn)生的偽像.同時引入新的透鏡改善光路,實現(xiàn)了大范圍的掃描成像.最終達到了單幅圖像穩(wěn)定成像的速度約275幀/s,縱向分辨率和橫向分辨率分別為5.5和0.73 μm,掃描范圍約達138 μm的成像性能,這對于推動較大尺寸活體生物的實時清晰探測具有重要意義.