王 蕾，楊艷麗，張 鳳，李佳佳，耿英華，李 駿

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類嚴(yán)重危害人類健康的異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率占我國成人白血病首位。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3A(DNA methyltransferase 3A,DNMT3A)位于人類2號(hào)染色體短臂2區(qū)3帶(2p23)，是重要的甲基化轉(zhuǎn)移酶之一，主要負(fù)責(zé)基因組DNA從頭甲基化，在多種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[1-3]。研究[4-13]發(fā)現(xiàn)，在成人AML病人中DNMT3A R882位點(diǎn)高頻突變，且常合并某些高危因素，是病人預(yù)后不良的重要分子生物學(xué)標(biāo)志。本研究旨在通過收集臨床骨髓標(biāo)本及檢測DNMT3A R882位點(diǎn)突變情況，探討DNMT3A R882突變與AML發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2012年12月至2015年12月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院被診斷為初發(fā)AML病人的骨髓標(biāo)本116例及被診斷為缺鐵性貧血病人的骨髓標(biāo)本30例作為良性對照組。AML組男71例，女45例，年齡18～89歲。臨床分型：M1型15例，M2型36例，M4型30例，M5型35例。所有病人均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢查，并按照FAB國際分型標(biāo)準(zhǔn)明確診斷。良性對照組樣本30例，男12例，女18例，年齡23～75歲。所有骨髓標(biāo)本均經(jīng)病人或家屬簽署知情同意書。

治療方案：AML病人住院后均接受誘導(dǎo)緩解治療，方案為蒽環(huán)類藥物+阿糖胞苷(3 d+7 d)，如IA(去甲氧柔紅霉素3 d+阿糖胞苷7 d)、DA(柔紅霉素3 d+阿糖胞苷7 d)等，劑量參照《血液科臨床處方手冊》，并根據(jù)病人身高、體質(zhì)量及體表面積而定。

療效及隨訪：對116例AML病人通過查詢住院病歷、門診病歷及打電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止日期為2016年12月31日。完全緩解(complete remission,CR)定義為病人經(jīng)初次或2次誘導(dǎo)緩解治療后滿足以下條件：(1)白血病癥狀及體征消失；(2)外周血中性粒細(xì)胞絕對數(shù)≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，白細(xì)胞分類中無白血病細(xì)胞；(3)骨髓原始細(xì)胞總數(shù)≤5%。總體生存時(shí)間(overall survival time，OS)定義為AML被確診之日至死亡或末次隨訪的時(shí)間。無病生存時(shí)間(disease-free survival time,DFS)定義為經(jīng)治療獲得CR后至復(fù)發(fā)或死亡的時(shí)間。

1.2 主要試劑和儀器 超低溫冰箱(-80 ℃)、低溫高速離心機(jī)(Thermo科技公司)；核酸蛋白檢測儀(Eppendorf科技公司)；梯度PCR擴(kuò)增儀(東勝國際貿(mào)易有限公司)；水平式凝膠電泳槽及電泳儀、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Tanon科技公司)；DNA上樣緩沖液(6×)、TIANamp Genomic DNA Kit(天根生化科技有限公司)；Marker、5×TBE緩沖液、溴化乙錠(上海生物工程股份有限公司)。

1.3 DNA提取及突變檢測 將收集到的骨髓標(biāo)本提取單個(gè)核細(xì)胞后，根據(jù)DNA提取試劑盒說明提取基因組DNA，置于分光光度計(jì)中檢測DNA濃度及純度，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及瓊脂糖凝膠電泳，將高純度的DNA送于上海生物工程股份有限公司進(jìn)行DNMT3A R882突變檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)和Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.2 AML中DNMT3A R882突變型與野生型病人基本資料比較 DNMT3A R882在核型正常的AML組(NK-AML組)病人中突變率為19.4%，高于在核型異常的AML組病人中突變率的4.5%(P<0.05)。M4、M5分型人數(shù)在DNMT3A R882突變型AML組(Mut-DNMT3A組)中占75.0%，在DNMT3A野生型AML組(Wild-DNMT3A組)中占30.0%，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表1)。

另外，Mut-DNMT3A組病人年齡大于Wild-DNMT3A組(uc=2.32，P<0.05)；Mut-DNMT3A組病人外周血白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)高于Wild-DNMT3A組(P<0.05)，但2組間病人性別、骨髓原始細(xì)胞數(shù)、外周血血紅蛋白數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 Mut-DNMT3A組與Wild-DNMT3A組間病人基本資料的比較

變量DNMT3A R882突變 (+) (-) tP性別 男 女11560400.45?>0.05年齡/歲59.5±13.545.0±15.22.32<0.05骨髓原始細(xì)胞數(shù)/% 69.2±21.662.1±18.30.87>0.05白細(xì)胞數(shù)/(×109/L)43.2±21.926.4±23.42.08<0.05血紅蛋白/(g/L) 83.9±26.975.2±21.10.57>0.05血小板/(×109/L)74.3±40.137.8±39.73.02<0.01NK-AML組 非NK-AML組 14258425.91?<0.05M4、M5分型組M1、M2分型組124307012.09?<0.01

*示χ2值

2.3 AML中DNMT3A R882突變型與野生型病人融合基因比較 檢測成人AML病人中融合基因的表達(dá)是判斷病人病情與預(yù)后的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CBFβ-MYH陽性者在Mut-DNMT3A組中占12.5%，在Wild-DNMT3A組中占8.0%，2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AML1-ETO陽性者在Wild-DNMT3A組中占18.0%，而在Mut-DNMT3A組中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)陽性者，2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

2.4 AML中DNMT3A R882突變與野生型病人細(xì)胞免疫表型比較 Mut-DNMT3A組與Wild-DNMT3A組細(xì)胞表面CD117、CD13、CD33、CD36、CD14、CD15、CD56、CD64、MPO、HLA-DR表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表2 Mut-DNMT3A組與Wild-DNMT3A組間病人融合基因的比較

融合基因DNMT3A R882突變 (+) (-) 校正χ2PCBFβ-MYH 陽性 陰性2148920.01>0.05AML1-ET0 陽性 陰性01618822.17>0.05

表3 Mut-DNMT3A組與Wild-DNMT3A組間病人細(xì)胞免疫表型比較

CD抗原DNMT3A R882突變 (+) (-) χ2PCD117 陽性 陰性8856440.20>0.05HLA-DR 陽性 陰性15185150.89>0.05CD13 陽性 陰性12478220.07>0.05CD33 陽性 陰性11575250.28>0.05CD15 陽性 陰性11553471.38>0.05MPO 陽性 陰性13372280.60>0.05CD56 陽性 陰性31322780.09>0.05CD36 陽性 陰性41213871.59>0.05CD64 陽性 陰性3139911.41>0.05CD14 陽性 陰性8838620.83 >0.05

2.5 療效及臨床預(yù)后 116例AML病人住院期間接受誘導(dǎo)緩解治療后，16例Mut-DNMT3A病人中有7例CR，CR率為43.8%，100例Wild-DNMT3A組病人中有47例CR，CR率為47.0%，2組間CR率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.06，P>0.05)。

進(jìn)一步分析Mut-DNMT3A組與Wild-DNMT3A組之間的OS率及DFS率，結(jié)果顯示，Mut-DNMT3A組病人中位生存時(shí)間為12個(gè)月，Wild-DNMT3A組病人中位生存時(shí)間為28個(gè)月，Mut-DNMT3A組病人OS率及DFS率均低于Wild-DNMT3A組病人，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(χ2=4.29、6.16，P<0.05)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)檢測到DNMT3A R882在AML組中突變率為13.8%，在良性對照組中無突變，由于對照組中病例數(shù)偏少，2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DNMT3A R882在NK-AML中突變率為19.4%，與以往發(fā)現(xiàn)的DNMT3A R882在AML中突變率為9.3%～19.7%、在NK-AML中達(dá)18.1～27%[4-11]相符。

細(xì)胞表面相關(guān)免疫表型的表達(dá)可以判斷骨髓細(xì)胞來源及發(fā)育程度，章梁君等[9]研究指出DNMT3A R882突變的AML病人中細(xì)胞表面CD14與CD56分子表達(dá)顯著增高，而本研究雖然顯示M4、M5分型的病人人數(shù)在Mut-DNMT3A組中所占比例高于Wild-DNMT3A組，不過在分析2組間細(xì)胞免疫表型表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)2組間與單核細(xì)胞表面標(biāo)志相關(guān)的CD14、CD64、CD36、CD56分子表達(dá)差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是因?yàn)榧?xì)胞表面CD分子分化程度，或是成熟程度不一所造成的結(jié)果。

我們在分析Mut-DNMT3A組與Wild-DNMT3A組間AML1-ETO及CBFβ-MYH融合基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)2組間人數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但我們的研究發(fā)現(xiàn)Mut-DNMT3A更易發(fā)生于NK-AML病人，且EL GHANNAM 等[8]研究發(fā)現(xiàn)Mut-DNMT3A常伴有 NMP1、FLT3-ITD突變，特別是 NMP1突變常與DNMT3A R882突變關(guān)系密切[ 6-10]。這可能是由于我們分析的融合基因種類少的原因，且提示當(dāng)病人染色體核型正常，合并NMP1、FLT3-ITD突變時(shí)，可進(jìn)一步檢測DNMT3A R882突變。

我們雖然發(fā)現(xiàn)Mut-DNMT3A組病人年齡、外周血白細(xì)胞數(shù)及血小板數(shù)高于Wild-DNMT3A組，與HOU等[7]發(fā)現(xiàn)的其中一部分相符，但其亦指出Mut-DNMT3A組病人中骨髓原始細(xì)胞數(shù)顯著增加，而我們的研究顯示Mut-DNMT3A組病人骨髓原始細(xì)胞數(shù)雖然較Wild-DNMT3A組病人增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也有研究[12]指出AML病人骨髓原始細(xì)胞數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)及年齡與DNMT3A R882是否突變無關(guān)。造成各研究中出現(xiàn)差異的原因可能有人種的不同、病例收集數(shù)量不同、實(shí)驗(yàn)研究方法不同及誤差等。

大量研究[10-13]顯示DNMT3A R882突變病人復(fù)發(fā)率極高、生存率下降，預(yù)示著病人預(yù)后不良。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Mut-DNMT3A組與Wild-DNMT3A組間病人CR率差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Mut-DNMT3A組病人OS率、DFS率較Wild-DNMT3A組病人均下降，提示DNMT3A R882突變可能是AML病人預(yù)后不良的生物學(xué)標(biāo)志。

通過本實(shí)驗(yàn)研究可以得出DNMT3A R882突變易發(fā)生于AML病人，特別是NK-AML或M4、M5病人，且常合并高齡、高白細(xì)胞危險(xiǎn)因素，DNMT3A R882突變使OS率及DFS率顯著下降，是病人預(yù)后不良的生物分子學(xué)標(biāo)志，也提示DNMT3A R882突變在AML的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，仍需大量研究進(jìn)一步闡明細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制在其中的作用。