王振杰，徐志鵬，陳 硬，宋 琦

創(chuàng)傷失血性休克(THS)是創(chuàng)傷導(dǎo)致死亡最主要的原因之一[1]。嚴重失血、凝血功能障礙和嚴重感染以及繼發(fā)造成的全身炎癥反應(yīng)綜合癥及多器官功能障與死亡率直接相關(guān)[2]，有效控制出血和液體復(fù)蘇是提高生存率的主要治療措施。既往研究[3]表明，液體復(fù)蘇有益于THS組織灌注的恢復(fù)、組織缺氧的預(yù)防、細胞因子作用的減弱以及組織細胞凋亡的減少等。THS繼發(fā)的心肌損傷具有較差的生存率[4]，其機制尚不完全清楚，但心肌細胞中基因異常上調(diào)可調(diào)控相關(guān)蛋白和炎癥因子的表達，包括核因子κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及白細胞介素(IL)-6等[5]。發(fā)生THS后，NF-κB激活炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加快促炎因子如TNF-α的釋放[6]。研究[7-8]表明，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活對于失血性休克所致急性肝、肺損傷發(fā)揮重要介導(dǎo)作用，但其在THS所致心肌損傷中的研究較少。最近一項研究[9]表明，炎癥介質(zhì)的體外釋放受到MAPKs影響，如c-Jun NH2-末端激酶(JNK)、p38MAPK和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)。JNK在介導(dǎo)IL-6和TNF-α的表達中發(fā)揮重要作用[10]。MAPK磷酸酶(MKP-1)可通過去磷酸化導(dǎo)致包括JNK在內(nèi)的MAPK失活，調(diào)節(jié)MKP-1表達的機制對于確定MAPK磷酸化的持續(xù)時間和免疫應(yīng)答至關(guān)重要[11-12]。本研究旨在探討NF-κB、MKP-1及JNK在THS相關(guān)心肌損傷進展中的潛在作用，探討醋酸鈉林格液相對常規(guī)復(fù)蘇液乳酸鈉林格液及對THS的早期復(fù)蘇效果，并進一步驗證通過調(diào)控NF-κB和MAPK信號表達保護THS相關(guān)心肌損傷的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康SD大鼠32只，SPF級，雌雄不限，體質(zhì)量(300±20)g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供(上海，中國)。實驗動物于室溫(22±1)℃、濕度45%～55%、12 h光照/黑暗周期條件下飼養(yǎng)7 d。醋酸鈉林格液購于湖南康源制藥有限公司(瀏陽，中國)，0.9%氯化鈉溶液及乳酸鈉林格液購于安徽環(huán)球藥業(yè)股份有限公司(蚌埠，中國)，Trizol、UltraPure Agarose、Sybr qpcr mix、SuperScript Ⅲ RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司，JNK抗體、MKP-1抗體、p65(Ser536)抗體、p65(Lys310)抗體購于MDL公司(北京，中國)。

1.2 方法 SD大鼠隨機分為失血性休克未復(fù)蘇組(CR組)、0.9%氯化鈉溶液復(fù)蘇組(NR組)、乳酸鈉林格液復(fù)蘇組(LR組)和醋酸鈉林格液復(fù)蘇組(AR組)，各8只。4組大鼠均制備失血性休克模型：腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行麻醉，大鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)備皮、消毒、鋪巾，分離股動脈和股靜脈。右側(cè)股動脈置管連接MedLab-U/4C501H生物信號采集處理系統(tǒng)，監(jiān)測平均動脈壓(MAP)(2.5%枸櫞酸鈉沖洗測壓系統(tǒng))，左側(cè)股動脈置管放血制作休克模型，右側(cè)股靜脈置管用于液體復(fù)蘇，左側(cè)股靜脈連接微量泵。置管后適應(yīng)20 min，用1 mL注射器(已預(yù)先填充枸櫞酸鈉溶液0.1 mL)從左側(cè)股動脈以2 mL/3 min速度緩慢放血，直到MAP達30 mmHg，此過程大概需要20 min。通過緩慢回輸自體血或少量緩慢放血維持MAP(30 mmHg)60 min后，NR組、LR組和AR組大鼠經(jīng)右側(cè)股靜脈分別泵入0.9%氯化鈉溶液、乳酸鈉林格液、醋酸鈉林格液(速度<20 mL/h)，CR組誘導(dǎo)休克后不予以復(fù)蘇，觀察4 h。復(fù)蘇組(NR組、LR組和AR組)液體復(fù)蘇成功后(MAP維持在80 mmHg)，觀察4 h，處死大鼠，取心組織置于-80 ℃冰箱保存。本實驗經(jīng)蚌埠醫(yī)學院實驗動物管理和倫理委員會批準進行。

1.3 觀察指標

1.3.1 實時熒光定量PCR法檢測大鼠心肌組織TNF-α mRNA、IL-4 mRNA及IL-10 mRNA相對表達量 用Trizol試劑盒提取大鼠心肌組織RNA：反轉(zhuǎn)錄應(yīng)用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒superscript Ⅲ配制反應(yīng)液，65 ℃滅活10 min去DNA，加入引物混合物，42 ℃逆轉(zhuǎn)錄60 min，置于85 ℃反應(yīng)10 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)結(jié)束后置-20 ℃待用。將cDNA稀釋10倍，作為PCR模板加入引物反應(yīng)體系，于ABI 7900 qPCR儀上，按照95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，進行40個循環(huán)，讀取Ct值并計算2-ΔΔCt，得到結(jié)果。各引物序列見列表1。

表1 目的基因引物序列

1.3.2 Western blotting法檢測大鼠心肌組織JNK磷酸化、MKP-1乙?；65(Ser536)磷酸化和P65(Lys310)乙?；鞍紫鄬Ρ磉_量 取冷凍保存的大鼠心肌組織，加入裂解液作用1 min，離心30 min，取上清即細胞總蛋白置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｊ褂肂CA 試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后通過轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上分離到的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉120 min后，加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，加入堿性磷酸酶(AP)標記的二抗室溫孵育60 min，TBST 洗膜3次，ECL化學發(fā)光、顯影、定影、拍照。計算目的蛋白與β-actin灰度值比值，進行統(tǒng)計學分析。

1.3.3 大鼠心肌組織病理學檢查 大鼠心肌組織經(jīng)10%甲醛溶液內(nèi)固定，石蠟包埋且卡片，HE染色，在光鏡下進行心肌組織形態(tài)學觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織形態(tài)學觀察 誘導(dǎo)休克維持4 h后，CR組大鼠心肌細胞混濁腫脹，間質(zhì)水腫明顯，可見紅細胞外滲；復(fù)蘇成功后維持4 h，AR組大鼠心肌組織損傷程度較NR組和CR組明顯改善(見圖1)。

2.2 4組大鼠心肌組織相關(guān)細胞因子mRNA表達水平比較 THS復(fù)蘇成功4 h后，NR組、LR組和AR組大鼠心肌組織TNF-α mRNA表達水平均明顯低于CR組(P<0.01)，LR組和AR組IL-10 mRNA均高于CR組(P<0.05和P<0.01)，AR組IL-4 mRNA均明顯高于LR組、NR組和CR組(P<0.01)(見表2)。

分組nIL-4 mRNA IL-10 mRNA TNF-α mRNA CR組80.63±0.73 0.49±0.35 11.92±7.81 NR組81.45±1.142.46±1.454.33±2.72??LR組82.53±0.726.07±4.46?3.27±1.59??AR組86.97±4.39??##ΔΔ7.81±6.04??#1.33±0.80??F—11.82 6.07 9.63 P—<0.01 <0.01 <0.01 MS組內(nèi)—5.406 14.650 17.891

q檢驗：與CR組比較*P<0.05，**P<0.01；與NR組比較#P<0.05，##P<0.01；與LR組比較ΔΔP<0.01

2.3 4組大鼠心肌組織p65(Ser536)磷酸化、p65(Lys310)乙?；蚃NK磷酸化、MKP-1乙?；鞍紫鄬Ρ磉_量比較 復(fù)蘇成功4 h后，復(fù)蘇組大鼠p65(Ser536)磷酸化、p65(Lys310)乙?；?、JNK磷酸化蛋白相對表達量均低于CR組(P<0.05～P<0.01)，且AR組均低于NR組和LR組(P<0.05～P<0.01)；復(fù)蘇組MKP-1乙酰化蛋白相對表達量均高于CR組(P<0.05～P<0.01)，且AR組和LR組均明顯高于CR組(P<0.01)(見圖2、表3)。

3 討論

全球每年大約有190萬人因失血導(dǎo)致死亡，其中150萬人死于創(chuàng)傷所致[3,13]。盡管隨著急救模式的不斷改進和休克復(fù)蘇指南的普及學習，失血性休克早期復(fù)蘇成功率有了較大提高，但后期死亡率仍然居高不下，這可能與休克誘發(fā)機體細胞因子和炎性介質(zhì)失控性釋放，并由此介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合癥、組織細胞損傷甚至多器官功能障有關(guān)[14]。創(chuàng)傷后繼發(fā)性心臟損傷是創(chuàng)傷病人預(yù)后的一個關(guān)鍵因素，但其機制尚未完全闡明。本研究通過建立THS模型，明確了NF-κB及MAPK信號通路在心肌炎癥損傷過程中發(fā)揮重要作用。

p50和p65是NF-κB在經(jīng)典激活途徑中研究最為常見的2個二聚體，并且p50和p65的激活與細胞存活和炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[15]。在細胞和組織遭受各種刺激或者損傷時可誘導(dǎo)p65發(fā)生磷酸化，特別是p65絲氨酸536位點磷酸化已成為轉(zhuǎn)錄激活新機制[16]。p65(Ser536)磷酸化通過增加組蛋白乙?；概cp65的結(jié)合進而促進p65(Lys310)乙?；?。p65乙?；稍鰪娕cDNA 的結(jié)合能力，繼而增強NF-κB 對促炎因子的調(diào)控[17]。因此，本研究測定p65(Ser536)磷酸化及p65(Lys310)乙?；鞍紫鄬Ρ磉_量來反映不同復(fù)蘇液復(fù)蘇對大鼠促炎核轉(zhuǎn)錄因子活性影響。

表3 4組大鼠p65(Ser536)磷酸化、p65(Lys310)乙?；?、JNK磷酸化和MKP-1乙?；鞍紫鄬Ρ磉_量比較

q檢驗：與CR組比較*P<0.05，**P<0.01；與NR組比較#P<0.05，##P<0.01；與LR組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

MAPK在受到細胞外多種刺激因素和信號分子，如缺血再灌注損傷、細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等刺激后，發(fā)生磷酸化而活化，并將細胞外界刺激信號放大并轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)，驅(qū)動下游細胞因子以轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄方式激活導(dǎo)致不同的細胞內(nèi)反應(yīng)[18-19]。JNK作為MAPK家族一員，其信號表達在維持細胞正常狀態(tài)和應(yīng)激表達過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[20-21]。MKP-1作為p38MAPK和JNK的底物，通過去磷酸化作用使MAPK失活，MKP-1表達機制的干預(yù)對于MAPK磷酸化的持續(xù)過程及免疫應(yīng)答的反應(yīng)時間至關(guān)重要[22]。因此，本研究測定JNK磷酸化及MKP-1乙?；磉_水平來反映不同復(fù)蘇液復(fù)蘇對大鼠MAPK信號通路的影響。

創(chuàng)傷性損傷后立即治療和抗休克處理已成為現(xiàn)代創(chuàng)傷救治的關(guān)鍵措施。除了手術(shù)控制出血外，液體復(fù)蘇仍然是最重要的挽救生命的干預(yù)措施之一，并且有證據(jù)[23]表明，對于大多數(shù)低血容量病人，推薦晶體液作為一線復(fù)蘇液體。然而關(guān)于最佳晶體液的選擇，臨床一直存有較大爭議。近來研究[24]表明，醋酸鈉林格液林格液作為一種新型平衡鹽溶液，與0.9%氯化鈉溶液及乳酸鈉林格液相比，能夠維持較高碳酸氫鹽水平及降低堿缺乏量，較少導(dǎo)致高血糖。有研究表明，在脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)中，醋酸鈉能夠抑制p38和JNK的磷酸化，來抑制促炎細胞因子表達及提升抗炎細胞因子的水平進而減輕其小膠質(zhì)細胞的炎癥[25]。本研究結(jié)果顯示，與0.9%氯化鈉溶液和乳酸鈉林格液比較，采用醋酸鈉林格液復(fù)蘇失血性休克大鼠，可明顯降低p65(Ser536)磷酸化及p65(Lys310)乙?；磉_水平。提示醋酸鈉林格液能夠下調(diào)失血性休克大鼠心組織p65(Ser536)磷酸化水平，從而阻止組蛋白乙?；概cp65結(jié)合，進而逆轉(zhuǎn)了p65(Lys310)乙?；?。同時，醋酸鈉林格液復(fù)蘇失血性休克大鼠可提高大鼠心肌組織MKP-1乙酰化表達水平及降低JNK磷酸化表達水平。經(jīng)醋酸鈉林格液復(fù)蘇后，大鼠TNF-α表達水平明顯低于休克未復(fù)蘇組，我們推測醋酸鈉林格液通過抑制NF-κB及MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少下游致炎因子的釋放。

此外，IL-4和IL-10作為2種重要的抗炎因子均能夠通過下調(diào)炎性介質(zhì)包TNF-α和IL-1等，促進體液免疫反應(yīng)[26]。動物研究[27]表明，IL-10水平升高可以保護心臟細胞免受急性心肌炎的損害。本研究結(jié)果顯示，與乳酸鈉林格液和0.9%氯化鈉溶液比較，醋酸鈉林格液復(fù)蘇失血性休克大鼠可以明顯提高IL-4 mRNA表達水平，IL-10 mRNA表達水平亦明顯高于0.9%氯化鈉溶液，說明醋酸鈉林格液能夠逆轉(zhuǎn)促炎因子和抗炎因子表達失衡，從而保護心肌損傷。

綜上，醋酸鈉林格液復(fù)蘇失血性休克大鼠，可通過抑制NF-κB及MAPK途徑減少致炎因子TNF-α水平，同時可以增加抗炎因子IL-4和IL-10水平來保護休克造成的心肌損傷。但該結(jié)論仍需要進一步的基礎(chǔ)研究和臨床研究加以證實。