●盛佳鈺 吳建春 范建兵 李春陽 董夢婷 江 科▲

三陰性乳腺癌是乳腺癌中具有高度侵襲性生物學行為的亞型，發(fā)病年齡較小，組織學分級高，較早發(fā)生局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移[1]。本課題組前期對347例三陰性乳腺癌患者的隨訪顯示，其5年的無病生存率為76%，總生存率為81%，明顯低于其他類型的乳腺癌患者[2-3]。多年來，現(xiàn)代醫(yī)學界一直在尋找三陰性乳腺癌治療的新靶點，并試圖通過開發(fā)新的治療方法及藥物，進一步提高療效及保持患者生活質(zhì)量，而中醫(yī)藥的發(fā)展很好的填補了此空缺。大量的研究證實，在乳腺癌患者治療的不同階段給予中醫(yī)藥的干預，可以有效的改善患者的免疫狀態(tài)，提高生活質(zhì)量，降低復發(fā)轉(zhuǎn)移率，延長無病生存期[4-6]。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，無論對于年輕或年老的三陰性乳腺癌患者，中藥均可以提高無病生存率[7]。近年來，“虛瘀致癌”理論逐漸被全國各地的醫(yī)家所認同，認為正氣不足是癌癥發(fā)生的根本原因，血瘀是癌癥發(fā)生的外在表現(xiàn)，“虛瘀致癌”是三陰性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的核心病機。由此，本研究組提出了益氣活血法治療三陰性乳腺癌的治療理念。本研究采用的益氣活血法中藥復方在臨床上療效顯著，但缺乏相關(guān)實驗性研究，遂利用體外細胞實驗觀察益氣活血方抑制MDA-MB-231增殖的作用并探討期可能的機制，為進一步開發(fā)益氣活血方的臨床價值奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 細胞株 人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231 購自中國科學院上海細胞庫，用含10%胎牛血清的L15 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入100 U/L 青霉素和10 mg/mL 鏈霉素。置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細胞貼壁情況并換液。貼壁生長良好的乳腺癌細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，選用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.1.2 藥品與試劑 紫杉醇購自selleck 公司（貨號S1150，規(guī)格10mM/1ml），純度99.86%，分子量853.92。

益氣活血方由黃芪、莪術(shù)按1：1比例組成。方中生藥均購于上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學中藥學院中藥鑒定教研室鑒定。煎前冷水浸泡30min，武火熬開后文火煎煮30min。采用水煎醇沉法，加入乙醇沉淀48h 后，取上層液體過0.22μm 濾膜，調(diào)整濃度配置成5g/mL 儲存液，置于4℃冰箱中保存。

L-15液體培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）均為Gibco 公司產(chǎn)品；四甲基氮唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）及DMSO均購自上海生工生物有限公司。細胞周期檢測試劑盒購置于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Kif15、Cyclin B1、Cyclin D、CDK1、內(nèi)參GAPDH（均為抗兔單克隆抗體）及其相應的二抗均購自美國Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 噻唑藍（MTT）比色法檢測細胞活性 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細胞懸液，按照5×104個/mL的密度接種于96孔板中，待細胞貼壁生長后，更換相應的無血清培養(yǎng)液使細胞饑餓培養(yǎng)24h。再換為各組含藥物的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每孔200μL，每組設6個復孔?？瞻讓φ战M：每孔只含有MDA-MB-231 細胞和培養(yǎng)基。陽性對照組：每孔含有MDA-MB-231細胞、培養(yǎng)基和10nM濃度紫杉醇。益氣活血方組：每孔含有MDA-MB-231 細胞、培養(yǎng)基和濃度分別為1.5625、3.125、6.25、12.5、25 g/L 的益氣活血方中藥湯液。于處理后的0、24、48h 后，于每孔避光加入20μL的0.5%MTT溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 溶液150μL 以溶解孔內(nèi)結(jié)晶物，采用490nm 波長的酶聯(lián)免疫吸附儀測定各孔的OD值。

細胞增殖抑制率的計算方法：細胞增殖抑制率=（1－實驗組光度吸收值OD 值/對照組光度吸收值OD值）×100%。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 流式細胞檢測分為4組，分別為空白對照組；陽性對照組：紫杉醇的濃度為10nM；益氣活血方低劑量組：濃度為3.125g/L 的益氣活血方中藥湯液。益氣活血方高劑量組：濃度為12.5g/L 的益氣活血方中藥湯液。細胞轉(zhuǎn)染后48h 用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化細胞，清洗一次，以2000 r/min 離心5min，離心后每組加入1×Annexin V Binding Buffer 100μL，充分混勻細胞，每組加入5μL FITC Annexin V染液，5μL PI染液，避光室溫反應15min，然后每管加300μL 1×Annexin V Binding Buffer溶液，1h流式細胞儀檢測。

1.2.3 Western Blot 檢測相關(guān)蛋白Kif15、Cyclin B1、Cyclin D、CDK1的表達 Western Blot 檢測細胞分為4組，分別為空白對照組；陽性對照組：紫杉醇的濃度為10nM；益氣活血方低劑量組：濃度為3.125g/L 的益氣活血方中藥湯液。益氣活血方高劑量組：濃度為12.5g/L 的益氣活血方中藥湯液。收集各組細胞后加入RIPA 裂解液，離心取上清，BCA 法測定蛋白質(zhì)含量，與5×蛋白上樣緩沖液混合后煮沸10min，取30μg蛋白樣本經(jīng)10% SDS-PAGE 膠進行分里，轉(zhuǎn)膜后將PVDF 膜用50g/L 脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗4 ℃搖床孵育過夜，常溫封閉相應二抗1h，用PBST到PBS過渡式洗滌3次，ECL法曝光顯影，凝膠成像儀掃描膠片并保存結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 所有的實驗均進行至少3 次，實驗結(jié)果以表示，用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計分析。不同藥物濃度組間的比較采用完全隨機設計的方差分析，各劑量組與對照組間以及各劑量組間的比較均采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣活血方對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞形態(tài)學的影響倒置顯微鏡下見正常對照組細胞生長旺盛，多呈橢圓形或多角形，細胞體完整，胞核較大，呈卵圓形居中。濃度為12.5g/L 的益氣活血方作用于MDA-MB-231 細胞，24h 內(nèi)變化不明顯，48h 之后，出現(xiàn)凋亡細胞，細胞體積縮小，形態(tài)變圓，出現(xiàn)細胞膜破損，細胞皺縮并脫落。72h后細胞變化最明顯，凋亡細胞增多，從瓶壁脫落，出現(xiàn)部分細胞碎片漂浮。見圖1。

圖1 12.5g/L濃度益氣活血方作用于MDA-MB-231細胞不同時間的細胞形態(tài)變化

2.2 益氣活血方對MDA-MB-231細胞增殖率的抑制作用采用MTT 比色法檢測益氣活血方作用于MDA-MB-231 細胞24、48h 的細胞增殖抑制率，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，益氣活血方對細胞的抑制作用明顯提高。各組增殖抑制率與空白對照組比較降低有統(tǒng)計學差異，其中12.5g/L、25 g/L 組的增殖抑制率與10nM 紫杉醇陽性對照組接近，兩者差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 益氣活血方作用24、48h對MDA-MB-231細胞抑制率的影響（%，n=3，）

表1 益氣活血方作用24、48h對MDA-MB-231細胞抑制率的影響（%，n=3，）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與空白對照組比較，**P＜0.01；與陽性對照組比較，▲P＜0.05；與陽性對照組比較，▲▲P＜0.01

2.3 益氣活血方對MDA-MB-231 細胞周期的影響流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，G0/G1期比例增加，S期比例逐漸降低，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。而G2/M期比例卻無明顯變化，提示益氣活血方對MDA-MB-231 細胞阻止在G1期。見圖2。

2.4 Western Blot 檢測Kif15、Cyclin B1、Cyclin D、CDK1的蛋白表達Western Blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：益氣活血方作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞48h后，與空白對照組相比，益氣活血方高劑量組（12.5 g/L）可明顯下調(diào)細胞周期相關(guān)的Kif15、Cyclin B1蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而Cyclin D、CDK1 蛋白表達改變無明顯統(tǒng)計學差異。見表2、圖3。

圖2 益氣活血方作用24h后MDA-MB-231細胞周期變化

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌術(shù)后患者多存在正氣虧虛、瘀血內(nèi)停，其一是因手術(shù)對人體損害，致使正氣外泄，氣血受擾；其二是因為術(shù)后放療、化療等給人體帶來的部分副反應，造成人體免疫功能低下，機體調(diào)節(jié)失衡，都是加重氣虛的病理因素；而腫瘤造成的瘀血狀態(tài)往往又可引起患者凝血功能異常，繼而造成新的微循環(huán)障礙，加重疾病發(fā)展[8]。對于腫瘤轉(zhuǎn)移，中醫(yī)理論則認為必須具備兩個條件:一是癌癥的邪氣盛，癌毒毒力旺盛導致氣血運行受擾，逐漸形成瘀血；二是被轉(zhuǎn)移的器官正氣虛，“最虛之處，便是容邪之地”，正氣虛的部位就建立了轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。因此，氣虛血瘀的患者更容易出現(xiàn)腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移?；谝陨侠碚?，課題組在臨床上長期應用益氣活血法治療三陰性乳腺癌，取得較確切的臨床療效。近年來，“虛瘀致癌”理論也逐漸被全國各地的醫(yī)家所認同，認為正氣不足是癌癥發(fā)生的根本原因，血瘀是癌癥發(fā)生的外在表現(xiàn)，“虛瘀致癌”是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的核心病機。課題組長期致力于“益氣活血法”治療乳腺癌的研究，目前在研的上海市科委課題，對已完成入組的150例三陰性乳腺癌病例最長26 個月的隨訪發(fā)現(xiàn)：益氣扶正聯(lián)合活血化瘀中藥組比單純益氣扶正中藥組患者有更長的無病生存期（DFS），提示益氣和活血中藥聯(lián)合使用可以更好的減少侵襲性疾病的復發(fā)風險。本研究通過抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖試驗，探討了其抗乳腺癌可能的機制。

表2 益氣活血方對MDA-MB-231細胞Kif15、Cyclin B1、Cyclin D、CDK1蛋白的表達（n=3，-x± s）

實驗結(jié)果表明：益氣活血方可抑制人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 增殖，使其發(fā)生不同程度的形態(tài)學改變，并且抑制作用具有劑量-時間依賴性。細胞周期的動態(tài)平衡是維持細胞自身穩(wěn)定的重要因素，它由細胞增殖、生長阻滯和細胞凋亡共同調(diào)節(jié)，并需要多種胞內(nèi)和胞外信號的共同參與[8-9]。G1/S 是細胞周期細胞分裂和增殖中最重要的調(diào)節(jié)點。如果在G1/S 期發(fā)生異常，可能導致正調(diào)節(jié)功能過度增強或負調(diào)節(jié)功能減弱或缺失，從而誘導腫瘤發(fā)生[10]。此外，G1/S也是DNA 復制、損傷和修復的關(guān)鍵時期，當損傷的DNA可以修復時，則繼續(xù)存活，如果DNA損傷不能有效修復，則細胞開始凋亡程序[11-12]。本研究流式細胞檢測結(jié)果表明，給予益氣活血方的MDA-MB-231 細胞G0/G1 期比例增加，S 期比例逐漸降低，G2/M 期比例卻無明顯變化，提示益氣活血方可影響了MDAMB-231 細胞的周期分布，使大多數(shù)細胞阻滯在G0/G1期，阻礙其項S期轉(zhuǎn)化，阻滯了細胞的DNA合成及有絲分裂，因此抑制了MDA-MB-231細胞的增殖。

圖3 益氣活血方對MDA-MB-231細胞凋亡、周期相關(guān)蛋白表達影響

本研究中Western blot 檢測結(jié)果提示：益氣活血方可顯著下調(diào)Cyclin B1、Kif15的表達，且具有濃度依賴性。細胞周期蛋白（Cyclins）是調(diào)控細胞周期的主要成分，細胞周期蛋白B1（Cyclin B1）在癌細胞中過表達，可能與激酶CDC2 形成復合物，啟動有絲分裂，越過細胞周期檢查點，導致失控性的細胞增殖有關(guān)[13]。此外，有絲分裂紡錘體是癌癥化療的主要靶點之一，也是一些知名的抗腫瘤增殖的藥物如紫杉烷類和長春花生物堿等的主要作用靶點[14-15]。驅(qū)動蛋白（kinesin）作為有絲分裂中必不可少的元件，是一類能利用ATP水解所釋放能量產(chǎn)生推力，進行細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸或者促進細胞運動的蛋白質(zhì)分子，在許多腫瘤中起著至關(guān)重要的作用，可用于預測癌癥的診斷和預后[16-17]。驅(qū)動蛋白家族成員-15（kinesin family member15，Kif15）是驅(qū)動蛋白超家族（kinesin superfamily protein）中的一員，Kif15 的異常表達與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[18-19]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Kif15基因表達與三陰性乳腺癌患者預后相關(guān)，敲除Kif15 基因?qū)θ幮匀橄侔┘毎鲋?、凋亡能力有顯著影響[21]。KIFs調(diào)控腫瘤細胞的周期，通過減少細胞對有絲分裂原的依賴，促進腫瘤細胞由G1 向S期不可逆的轉(zhuǎn)換，從而促進了細胞的增殖[20]。三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的有絲分裂率高，其異常增殖活躍的特性與KIFs介導的細胞周期的調(diào)控密切相關(guān)，本課題組前期研究結(jié)果也證實，益氣活血方可顯著下調(diào)MDA-MB-231細胞的Kif15的表達，從而抑制細胞周期增殖[21]。

目前，乳腺癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年增加且呈現(xiàn)年輕化趨勢，雖然新藥及臨床試驗層出不窮，但主要針對激素依賴性乳腺癌，而對三陰乳腺癌復發(fā)耐藥及維持治療等方面并不樂觀，缺少有效既經(jīng)濟又耐受性良好的維持治療藥物。本研究結(jié)果初步證實益氣活血方能通過調(diào)控腫瘤細胞周期抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞生長。然而，本研究僅僅為益氣活血法應用于治療三陰性乳腺癌的機制探討邁出了一小步，而中藥復方的抗腫瘤作用往往多途徑，其具體作用靶點有待我們深入研究。