劉 鈺，趙孟斌，于浩坤，楊 莉，呂 兵，王慶玲*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

雞蛋是一種優(yōu)質(zhì)膳食來源，在我國日常餐飲消費(fèi)中占據(jù)重要地位。雞蛋蛋黃中含有功能性磷脂組分，蛋清蛋白質(zhì)的氨基酸比例均衡，利于胃腸道吸收，因而具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[1-2]。在長期貯藏過程中，雞蛋品質(zhì)迅速劣變，并伴隨著蛋黃脂質(zhì)的水解及氧化[3]，同時(shí)，其加工性能迅速降低。研究表明，雞蛋貯藏過程中發(fā)生的諸如蛋黃pH值升高、水分含量增加、蛋黃指數(shù)下降等變化與蛋黃的功能性質(zhì)密切相關(guān)，并受貯藏時(shí)間、溫度、濕度等因素的影響[4]。

脂肪酶對(duì)雞蛋貯藏過程中的脂質(zhì)水解起關(guān)鍵作用，團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明雞蛋貯藏過程中中性脂肪酶、酸性脂肪酶、磷脂酶活性均顯著下降[3]，而最新的蛋黃蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，新鮮雞蛋黃中存在22 種蛋白酶/蛋白酶抑制劑及628 種多肽，表明蛋黃內(nèi)部存在抵御和調(diào)控氧化的分子基礎(chǔ)[5-6]。

為了深入了解內(nèi)源酶在雞蛋貯藏過程中對(duì)脂質(zhì)氧化的調(diào)控作用，本研究以不同貯藏時(shí)期的雞蛋為對(duì)象，明確雞蛋貯藏過程中蛋黃脂質(zhì)的氧化規(guī)律，重點(diǎn)考察雞蛋在不同貯藏時(shí)間下的蛋黃內(nèi)源酶活力動(dòng)態(tài)變化，以期明確雞蛋貯藏過程中內(nèi)源抗氧化酶對(duì)脂質(zhì)氧化的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)原料為產(chǎn)蛋24 h內(nèi)的海蘭褐殼蛋，購于石河子市宏鑫養(yǎng)殖場。

蛋白質(zhì)定量試劑盒、脂肪酶試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

X7酶標(biāo)儀 美國基因有限公司；Neofuge-15R冷凍離心機(jī) 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；YXQ-SG46-280S滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DK-8D恒溫水浴鍋金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

雞蛋于22 ℃、45%相對(duì)濕度條件下貯藏60 d，每10 d取樣一次分別測定表征脂質(zhì)氧化的過氧化值（peroxide value，POV）、MDA含量和脂肪酶、GSH-Px及T-SOD等內(nèi)源酶活力變化規(guī)律。

雞蛋破殼后去除蛋清，將蛋黃置于濾紙上，用蒸餾水緩慢沖洗殘余蛋清，換至另一濾紙上緩慢滾動(dòng)至蛋清和蒸餾水被濾紙吸收完全，使用滴管刺破蛋黃膜后吸取蛋黃液，收集蛋黃液于無菌干燥燒杯混勻備用。取一定量蛋黃液，加入4 倍體積生理鹽水，漩渦振蕩器充分混勻，3 500 r/min離心10 min，上清液作為樣品處理液，用于內(nèi)源酶活力測定。用無水乙醇代替生理鹽水制得樣品處理液，用于MDA含量的測定。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 總蛋白質(zhì)量濃度的測定

蛋黃中總蛋白質(zhì)量濃度的測定基于考馬斯亮藍(lán)法用試劑盒完成。

1.3.2.2 POV的測定

以氯仿-甲醇溶液為溶劑，進(jìn)行蛋黃脂質(zhì)的提取[7]，POV根據(jù)GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測定》，用硫代硫酸鈉溶液滴定法測定。

1.3.2.3 MDA含量的測定

MDA含量的測定基于硫代巴比妥酸法用試劑盒完成。

1.3.2.4 內(nèi)源酶活力、T-AOC的測定

利用試劑盒進(jìn)行樣品處理液的內(nèi)源酶活力和T-AOC的測定。脂肪酶活力采用比色法測定，T-AOC采用2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)快速法測定；GSH-Px活力采用比色法測定；T-SOD活力采用羥胺法測定；CAT活力的測定采用可見光分光光度法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)指標(biāo)測定至少3 組平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析，繪圖利用Origin 8.5軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞蛋貯藏過程中蛋黃總蛋白質(zhì)量濃度的變化

圖1 雞蛋貯藏過程中蛋黃總蛋白質(zhì)量濃度的變化Fig. 1 Changes in total protein concentration in egg yolk during storage

由圖1可知，雞蛋貯藏過程中蛋黃總蛋白質(zhì)量濃度總體呈顯著下降趨勢（P＜0.05），新鮮蛋黃總蛋白質(zhì)量濃度為22.08 g/L，貯藏50 d后降低至11.17 g/L，降低了49.41%。其主要原因在于雞蛋在貯藏過程中蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下會(huì)發(fā)生分解[8]，貯藏過程中蛋黃水分含量的增加也與蛋白質(zhì)量濃度減少有關(guān)。在貯藏60 d時(shí)，蛋黃中蛋白質(zhì)量濃度反而表現(xiàn)出略微上升，可能與貯藏后期蛋白酶抑制劑的作用有關(guān)。此外，貯藏后期雞蛋發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，可能出現(xiàn)散黃蛋[9-11]，蛋清和蛋黃混合使總蛋白質(zhì)量濃度在50～60 d升高了0.69 g/L。差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，蛋黃蛋白質(zhì)在貯藏過程中發(fā)生顯著變化。Gao Dan等對(duì)不同貯藏時(shí)間的蛋黃漿質(zhì)進(jìn)行二維電泳差異比對(duì)，發(fā)現(xiàn)33 個(gè)蛋白點(diǎn)12 種蛋白質(zhì)豐度發(fā)生顯著變化，進(jìn)一步研究分析表明蛋白酶抑制劑（如卵抑制劑、類α2-巨球蛋白）的降解對(duì)雞蛋貯藏過程中的品質(zhì)劣變發(fā)揮了重要作用[12]。該結(jié)果進(jìn)一步解釋了本研究貯藏后期蛋黃總蛋白質(zhì)量濃度上升的原因。楊小龍等[13]研究了貯藏溫度對(duì)雞蛋營養(yǎng)成分的影響，發(fā)現(xiàn)4 ℃和16 ℃貯藏條件下，蛋黃蛋白質(zhì)量濃度隨貯藏時(shí)間延長均呈波動(dòng)性下降趨勢，與本研究結(jié)果類似。

2.2 雞蛋貯藏過程中POV的變化

圖2 雞蛋貯藏過程中POV的變化Fig. 2 Changes in POV in eggs during storage

POV是衡量油脂氧化初期氧化程度的重要指標(biāo)。由圖2可知，雞蛋貯藏初期POV呈大幅上升趨勢，至貯藏第30天時(shí)POV達(dá)到最大值0.173 mg/g。究其原因，貯藏過程中雞蛋與外界進(jìn)行水分和氣體交換，蛋黃脂質(zhì)氧化程度不斷加劇。王慶玲等[14]同樣發(fā)現(xiàn)雞蛋在貯藏前15 d POV變化呈顯著上升趨勢。本研究中，貯藏30 d后蛋黃脂質(zhì)的POV基本趨于平穩(wěn)，貯藏后期未表現(xiàn)出POV繼續(xù)上升，這與初級(jí)氧化產(chǎn)物向次級(jí)氧化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變有關(guān)。當(dāng)油脂深度氧化時(shí)，氫過氧化物的氧化速率超過了生成速率，導(dǎo)致POV降低[15]，然而本研究中貯藏后期的POV呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)可能是蛋黃內(nèi)源抗氧化物質(zhì)的作用結(jié)果。

2.3 雞蛋貯藏過程中MDA含量的變化

圖3 雞蛋貯藏過程中MDA含量的變化Fig. 3 Changes in MDA content in eggs during storage

脂質(zhì)氧化過程中的主要次級(jí)產(chǎn)物是一些醛、酮、酸類[16]，MDA含量是衡量脂質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)。由圖3可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，MDA含量呈上升趨勢。雞蛋貯藏過程中MDA含量初始為0.22 nmol/mg，在40 d前大致平穩(wěn)但略有上升，貯藏40～60 d呈大幅上升，60 d時(shí)達(dá)2.70 nmol/mg。說明在貯藏過程中蛋黃脂質(zhì)發(fā)生了顯著的氧化反應(yīng)，次級(jí)氧化產(chǎn)物積累隨時(shí)間延長而增多。Galobart等則發(fā)現(xiàn)雞蛋在貯藏前60 d硫代巴比妥酸值先上升后下降[17]，說明脂質(zhì)氧化后期MDA含量減少，與本研究結(jié)果的差異主要在于其與本研究貯藏溫度不同，且飼料中添加了亞麻油等物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠抑制貯藏后期的蛋黃脂質(zhì)氧化反應(yīng)。

2.4 雞蛋貯藏過程中脂肪酶活力的變化

脂肪酶主要是指一類能夠催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯的酶[18]，其活力與雞蛋貯藏過程中的脂質(zhì)水解密切相關(guān)。由圖4可知，雞蛋貯藏過程中脂肪酶活力呈現(xiàn)顯著下降趨勢（P＜0.05）。經(jīng)過60 d的貯藏，脂肪酶活力由1.78 U/g降至0.29 U/g，較新鮮雞蛋下降了83.71%。研究結(jié)果表明脂肪酶活力與貯藏時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，脂肪酶在貯藏前期不斷發(fā)揮促進(jìn)脂質(zhì)水解的功能，而隨著貯藏時(shí)間延長，酶活力下降，導(dǎo)致其促進(jìn)脂質(zhì)水解的能力逐漸降低。王慶玲[3]對(duì)雞蛋貯藏過程中脂質(zhì)變化規(guī)律研究表明：蛋黃脂質(zhì)尤其是磷脂含量隨貯藏時(shí)間延長不斷降低歸功于內(nèi)源酶誘導(dǎo)的磷脂水解，且貯藏前期脂質(zhì)水解強(qiáng)度更大，此結(jié)論與本研究中脂肪酶活力測定的結(jié)果相互印證。

2.5 雞蛋貯藏過程中GSH-Px活力的變化

圖5 雞蛋貯藏過程中GSH-Px活力的變化Fig. 5 Changes in GSH-Px activity in eggs during storage

GSH-Px是一類具有抗氧化活性的蛋白酶類，其對(duì)保護(hù)蛋黃中諸如不飽和脂肪酸等成分具有重要的作用[19]。由圖5可知，在貯藏的前40 d，雞蛋GSH-Px活力顯著下降（P＜0.05），并在第40天達(dá)到最低值0.067 U/mg，而后呈波動(dòng)下降趨勢，這說明GSH-Px抗氧化能力隨著貯藏時(shí)間延長不斷降低。在貯藏40～50 d過程中，GSH-Px活力略升高，主要原因可能是貯藏后期蛋黃脂質(zhì)氧化產(chǎn)物累積，蛋黃游離卵磷脂中的卵黃高磷蛋白磷酸肽對(duì)脂質(zhì)過氧化發(fā)揮抑制作用[20]，從而促使GSH-Px活力從0.067 U/mg上調(diào)至0.245 U/mg。

2.6 雞蛋貯藏過程中T-SOD活力的變化

圖6 雞蛋貯藏過程中T-SOD活力的變化Fig. 6 Changes in T-SOD activity in eggs during storage

自由基是生物氧化過程中的副產(chǎn)物，主要包括超氧陰離子自由基及羥自由基。SOD能夠催化超氧陰離子自由基歧化為H2O2和O2[21]。由圖6可知，雞蛋貯藏過程中T-SOD活力表現(xiàn)出前期下降、貯藏中期顯著上升（P＜0.05）、而后又略下降的趨勢。0～20 d貯藏過程中T-SOD活力下降，20 d以后則表現(xiàn)出顯著上升，從0.20 U/mg升至2.87 U/mg（50 d），在第60天活力降至2.42 U/mg。前期T-SOD活力的下降歸因于蛋黃內(nèi)氧化體系的共同作用；貯藏中期T-SOD活力的上升可能是雞蛋在貯藏過程中被病毒或細(xì)菌等侵害，SOD參與了由病毒感染和細(xì)菌引起的免疫反應(yīng)，從而引起酶活力上升[22]，表明雞蛋內(nèi)部的抗氧化酶在貯藏過程中能夠發(fā)揮一定的抗氧化功能；而后期的T-SOD活力下降可能是由于貯藏后期蛋黃的pH值顯著上升[8]，導(dǎo)致T-SOD活力下降。

已有研究發(fā)現(xiàn)了與本實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)果，何青芬等[23]在對(duì)蛋黃抗氧化能力的研究中發(fā)現(xiàn)的SOD活力變化規(guī)律與本研究相同。Wawrzykowski等證明了蛋黃來源的SOD具有較高活力，并發(fā)現(xiàn)4 ℃貯藏6 d SOD活力顯著下降[24]；3 年后，該作者證實(shí)了蛋黃SOD可保護(hù)脂肪酸免受過氧化損傷[25]。趙啟龍等[26]在殼聚糖對(duì)蛋黃抗氧化功能的研究中，發(fā)現(xiàn)蛋黃在貯藏前期T-SOD活力緩慢下降，貯藏8 周出現(xiàn)顯著上升。

2.7 雞蛋貯藏過程中CAT活力的變化

CAT能將有害的活性氧H2O2分解為H2O和O2[27]。因此，雞蛋內(nèi)源CAT能夠抑制H2O2引起的雞蛋機(jī)體過氧化損傷。由圖7可知，雞蛋貯藏過程中CAT活力整體呈下降的趨勢，而在貯藏第20天略微上升，30 d時(shí)出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)。CAT活力在20～30 d時(shí)升高的原因在于這一階段SOD催化產(chǎn)生了過多的H2O2，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，從而使CAT活力升高。30 d后的活力下降則表明雞蛋內(nèi)源CAT的抗氧化作用減弱。孫寶麗等[28]在測定蛋黃中CAT活力的研究中發(fā)現(xiàn)在貯藏的第28天時(shí)CAT活力達(dá)最大值，與本研究結(jié)果類似。

圖7 雞蛋貯藏過程中CAT活力的變化Fig. 7 Changes in CAT activity in eggs during storage

2.8 雞蛋貯藏過程中T-AOC的變化

圖8 雞蛋貯藏過程中T-AOC的變化Fig. 8 Changes in T-AOC in eggs during storage

T-AOC反映機(jī)體抵御系統(tǒng)的抗氧化能力，代表了機(jī)體內(nèi)的酶和非酶抗氧化物的總體水平[29]。由圖8可知，雞蛋貯藏過程中T-AOC在貯藏的第20天達(dá)最大值1.60 mmol/L，20～30 d急劇下降，30～60 d下降平緩。這種變化歸結(jié)于貯藏前期在CAT、GSH-Px等抗氧化酶作用下雞蛋體現(xiàn)出較高的抗氧化能力，而后由于內(nèi)源酶活性的動(dòng)態(tài)波動(dòng)，導(dǎo)致T-AOC下降?？傮w上，雞蛋貯藏前期能夠維持較高的抗氧化能力，而貯藏后期抗氧化能力不斷下降。

2.9 相關(guān)性分析結(jié)果

圖9 蛋黃氧化指標(biāo)及酶活力相關(guān)性分析Fig. 9 Correlation analysis between lipid oxidation indices and endogenous enzyme activity in egg yolk

采用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）對(duì)不同的貯藏時(shí)間下的蛋黃氧化指標(biāo)及酶活力進(jìn)行相關(guān)性分析，建立PLS2模型，所得模型如圖9所示。氧化程度與抗氧化酶活力擬合率分別達(dá)到97%、59%?？偟鞍踪|(zhì)量濃度、脂肪酶活力、GSH-Px活力在圖中分布聚集度較高，說明總蛋白質(zhì)量濃度與脂肪酶誘導(dǎo)的脂質(zhì)水解密切相關(guān)，而T-AOC的下降歸因于GSH-Px、CAT活力隨貯藏時(shí)間延長的不斷降低。脂質(zhì)氧化指標(biāo)與脂肪酶活力具有顯著負(fù)相關(guān)性，脂肪酶誘導(dǎo)的脂質(zhì)水解對(duì)脂質(zhì)氧化具有重要貢獻(xiàn)，而隨著脂質(zhì)氧化程度的不斷加深，蛋黃總蛋白質(zhì)量濃度顯著降低。由分析結(jié)果可知，T-SOD與脂質(zhì)氧化程度表現(xiàn)出顯著正相關(guān)，說明貯藏過程中的蛋黃T-SOD活性被激活從而發(fā)揮一定的抗氧化能力。

在雞蛋貯藏后期，雖然GSH-Px、T-SOD活力表現(xiàn)出不同程度的升高，但蛋黃POV、MDA含量仍呈現(xiàn)上升趨勢，這是由于相比單一酶的抗氧化活性升高，T-AOC更能反映蛋黃整體抗氧化能力，它代表蛋黃中酶和非酶性抗氧化物的總體水平。此外，脂質(zhì)氧化的過程十分復(fù)雜，除酶促氧化之外，自動(dòng)氧化也是重要的氧化途徑[30]，最終導(dǎo)致蛋黃脂質(zhì)氧化能力大于其抗氧化酶體系的抗氧化能力。

3 結(jié) 論

隨貯藏時(shí)間延長，蛋黃脂質(zhì)氧化程度不斷加深，蛋黃T-AOC和GSH-Px、CAT活力逐漸下降，而T-SOD活力先下降后上升再下降的趨勢。相關(guān)性分析表明，脂質(zhì)氧化前期T-SOD、GSH-Px、CAT共同形成抗氧化防御體系，而氧化后期主要由T-SOD發(fā)揮抗氧化作用。