柳 焜，王 黎，胡 寧，陳小進(jìn)，廖夢(mèng)根

（武漢科技大學(xué) 環(huán)境污染綠色控制與修復(fù)技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430081）

隨著化石能源的燃燒，自然界中CO2的含量呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。由于在熱力學(xué)上的穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)上的惰性，CO2很難與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)［1］。利用微生物電合成系統(tǒng)（Microbial Electrosynthesis System，簡(jiǎn)稱MES）還原CO2是近幾年興起的一種電化學(xué)技術(shù)［2］。MES可以利用產(chǎn)電微生物電化學(xué)氧化還原反應(yīng)的聯(lián)合作用減少CO2轉(zhuǎn)化為增值化學(xué)品所需的熱力學(xué)能量，實(shí)現(xiàn)廢棄物向可利用的化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換［3-4］。

MES合成有機(jī)物的性能受到多種因素的影響，主要包括陰極材料、陰極微生物、陰極電勢(shì)、質(zhì)子交換膜等。祁家欣等［5］利用羥基改性碳布電極使乙酸的產(chǎn)量提高了243%。BATLLEVILANOVA等［6］利用巨球型菌（Megasphaerasp.）通過鏈延長(zhǎng)的方式將乙酸合成丁酸。XIANG等［7］采用雙極膜取代質(zhì)子交換膜，與使用質(zhì)子交換膜相比，乙酸產(chǎn)量提高了238%，并且在陰極的醋桿菌（Acetobacteriumsp.）相對(duì)豐度比之前高。而陰極電勢(shì)對(duì)MES中還原CO2合成有機(jī)物的過程也有重要的影響。例如JIANG等［8］發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定的陰極電勢(shì)下，MES能在固定CO2的同時(shí)合成乙酸等有機(jī)物，外加電勢(shì)對(duì)MES中產(chǎn)物的類型和組成及細(xì)胞的代謝有著極其重要的影響。這主要體現(xiàn)在過高的電極電勢(shì)或者過低的電極電勢(shì)會(huì)對(duì)電化學(xué)功能微生物產(chǎn)生負(fù)面的影響，并會(huì)導(dǎo)致電化學(xué)反應(yīng)體系中功能菌生長(zhǎng)代謝的酶減少，無(wú)法進(jìn)行物質(zhì)合成和能量代謝，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但是不同的陰極電勢(shì)對(duì)MES還原CO2合成有機(jī)物的能力的影響規(guī)律還缺乏較為全面的認(rèn)識(shí)。

本工作通過調(diào)節(jié)陰極電勢(shì)提升MES還原CO2合成有機(jī)物的性能，以期為MES的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料及試劑

MES菌種來(lái)自武漢市某污水處理廠厭氧池的活性污泥。

所用試劑均為分析純。

0.1 mol/L磷酸緩沖溶液：KH2PO46.8 g/L，NaOH 0.944 g/L，pH 6.0。微生物液體培養(yǎng)液：K2HPO42.18 g/L，KH2PO41.70 g/L，NaHCO32.50g/L，NH4Cl 1.25 g/L，KCl 0.10 g/L，MgCl2·6H2O 1.00 g/L，NaCl 0.80 g/L，CaCl2·2H2O 0.30 g/L，L-半胱氨酸 0.50 g/L，微量元素溶液10 mL/L，維生素溶液10 mL/L，pH 6.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MES的建立

MES采用3電極體系H型雙室反應(yīng)器，兩室容積均為500 mL，陰陽(yáng)兩極室之間通過陽(yáng)離子交換膜（厚度為0.16～0.23 mm，北京廷潤(rùn)膜技術(shù)開發(fā)股份有限公司）隔開。陽(yáng)離子交換膜在使用前置于0.5 mol/L的NaCl溶液中至少浸泡24 h，然后用去離子水清洗干凈，使得陽(yáng)離子交換膜充分水化和膨脹。用直徑0.5 mm的鈦絲作導(dǎo)線，陰極以碳?xì)郑?.00 cm×8.00 cm×0.10 cm）作為工作電極，陽(yáng)極以鈦板（8.00 cm×4.00 cm×0.05 cm）作為對(duì)電極，參比電極采用Ag/AgCl電極（218型，上海雷磁儀器有限公司，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)氫電極電勢(shì)為+0.197 V）并置于陰極電解室中。陽(yáng)極電解液為磷酸緩沖溶液，陰極電解液為微生物液體培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度（37±1）℃。在本實(shí)驗(yàn)中，所有的電勢(shì)數(shù)據(jù)均相對(duì)于Ag/AgCl參比電極，MES輸出電壓、電流監(jiān)測(cè)均采用電化學(xué)工作站（CHI660E型，上海辰華儀器有限公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)過程

活性污泥先置于干燥處進(jìn)行厭氧暴曬，以除去霉菌等不良微生物。取20 mL處理后活性污泥接入電化學(xué)反應(yīng)器陰極室，同時(shí)加入480 mL液體培養(yǎng)基，在陽(yáng)極室中加入500 mL磷酸緩沖液（pH=6.0），通過向陰極室中加入2-溴乙基磺酸鈉抑制污泥中產(chǎn)甲烷菌的活性［9］。陰極電極的電勢(shì)設(shè)為-0.70 V（相對(duì)于Ag/AgCl），在陰極室的底部通入CO2（純度＞99.999%）進(jìn)行微孔曝氣（曝氣流量20 mL/min，曝氣時(shí)間40 min，靜止時(shí)間4 h），其中陽(yáng)極進(jìn)行沒有微生物的氧化反應(yīng)，陰極進(jìn)行有電化學(xué)功能菌的還原反應(yīng)?；钚晕勰嗟鸟Z化周期為8 d，待每個(gè)周期結(jié)束后，檢測(cè)陰極液中有機(jī)物的濃度并置換出75%的陰極液開始下一個(gè)周期，直到陰極檢測(cè)到的有機(jī)物濃度與上一周期完全相同時(shí)，表明電化學(xué)功能菌馴化完成，微生物掛膜成功。然后利用電化學(xué)工作站分別設(shè)置5組實(shí)驗(yàn)組，陰極電勢(shì)分別設(shè)為-0.40，-0.50，-0.60，-0.70，-0.80 V，另外一組不施加外電勢(shì)（電勢(shì)為0 V）作為對(duì)照組。接通電源，內(nèi)置Ag/AgCl參比電極，反應(yīng)裝置連續(xù)運(yùn)行24 h，對(duì)反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3 分析方法

1.3.1 微生物形態(tài)的SEM表征

用無(wú)菌鑷子從陰極碳?xì)稚先? mm×5 mm大小的薄片，用2.5%（w）戊二醛固定液固定2.5 h；用磷酸緩沖溶液清洗3次，每次10 min；再分別利用30%，50%，70%，85%，95%（φ）的乙醇各脫水一次，每次15 min，100%濃度的乙醇脫水2次，每次20 min；最后用乙酸異戊酯置換2次，每次15 min。試樣干燥后用離子濺射儀（GVC2000型，上海禾早電子科技有限公司）噴金，采用掃描電子顯微鏡（XL 30 TMP型，荷蘭Philips公司）觀察陰極電極上微生物的形態(tài)。

1.3.2 細(xì)菌PCR高通量測(cè)序

反應(yīng)結(jié)束后，分別收集不同電勢(shì)下陰極碳?xì)稚系幕旌暇w，混合細(xì)菌的DNA提取采用細(xì)菌DNA提取盒（武漢華大基因有限公司）進(jìn)行。16S PCR擴(kuò)增采用通用引物的序列：正向引物采用F1：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物采用R1：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。通過Illumina Mise平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 合成有機(jī)物的高效液相色譜分析

采用高效液相色譜儀（U3000型，美國(guó)戴安公司），0.45 μm濾膜過濾，微量進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量20 μL，入C18反相檢測(cè)柱，流動(dòng)相為0.01 mol/L NaH2PO4溶液（pH為3.0），流量0.5 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.3.4 電化學(xué)分析

MES穩(wěn)定運(yùn)行一段時(shí)間后，陽(yáng)極連接對(duì)電極，陰極連接工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，利用電化學(xué)工作站對(duì)MES進(jìn)行循環(huán)伏安（CV）掃描。CV掃描參數(shù)：掃描電勢(shì)范圍-1.0～0.8 V，掃描頻率0.005 V/s。

反應(yīng)結(jié)束后，通過陰極液中各產(chǎn)物的最終積累量計(jì)算MES的總庫(kù)倫效率，計(jì)算方法參考文獻(xiàn)［10］。庫(kù)倫效率是指微生物在陰極上捕獲電子轉(zhuǎn)化為有機(jī)物的效率。

2 結(jié)果與討論

2.1 MES還原CO2合成有機(jī)物分析

在MES中，微生物在電流的驅(qū)動(dòng)下還原CO2合成甲酸和乙酸。合成產(chǎn)物甲酸（a）、乙酸（b）積累量隨時(shí)間的變化見圖1。

由圖1a可見：在反應(yīng)的前18 h，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，甲酸積累量的上升趨勢(shì)十分明顯，隨后上升速率降低直至趨于穩(wěn)定；當(dāng)陰極電勢(shì)從-0.40 V降至-0.50 V時(shí)，甲酸的積累量相差不大，可能的原因是較小的電勢(shì)差對(duì)微生物代謝影響較??；在陰極電勢(shì)為-0.70 V時(shí)，甲酸的積累量最大，反應(yīng)24 h時(shí)達(dá)到1.554 mmol/L，其產(chǎn)生速率約為0.065 mmol/（L·h）；當(dāng)陰極電勢(shì)進(jìn)一步降至-0.80 V時(shí)，反應(yīng)24 h時(shí)的甲酸的積累量降為1.467 mmol/L。

圖1b可見：隨著反應(yīng)的進(jìn)行，乙酸的積累量在整體上隨著反應(yīng)的進(jìn)行呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)；當(dāng)陰極電勢(shì)在-0.70 V時(shí)，反應(yīng)24 h時(shí)的乙酸的積累量最大，為2.754 mmol/L。

圖1 合成產(chǎn)物甲酸（a）、乙酸（b）積累量隨反應(yīng)時(shí)間的變化

2.2 總庫(kù)倫效率分析

庫(kù)倫效率能夠反映MES中微生物捕獲電子以及吸收電子催化還原底物合成轉(zhuǎn)化相應(yīng)產(chǎn)物的能力［11］。陰極電勢(shì)對(duì)MES庫(kù)倫效率的影響見圖2。由圖2可見：整個(gè)系統(tǒng)的總庫(kù)倫效率變化范圍在41.07%～81.42%之間，其中有機(jī)物的庫(kù)倫效率在39.23%～75.80%之間；陰極電勢(shì)為-0.70 V時(shí)，系統(tǒng)的總庫(kù)倫效率最大，為81.42%，此條件下乙酸的庫(kù)倫效率為66.44%，比BAJRACHARYA等［12］報(bào)道的乙酸庫(kù)倫效率（40%）要高；總庫(kù)倫效率最小值為-0.40 V時(shí)的41.07%，與NEVIN等［13］的研究結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果稍低；陰極電勢(shì)為-0.80 V時(shí)，總庫(kù)倫效率為77.09%；陰極電勢(shì)為-0.50～-0.60 V時(shí)，總庫(kù)倫效率為42.91%～56.60%。

圖2 陰極電勢(shì)對(duì)MES庫(kù)倫效率的影響

2.3 電化學(xué)分析

不同陰極電勢(shì)下反應(yīng)后MES的CV曲線見圖3。

圖3 不同陰極電勢(shì)下反應(yīng)后MES的CV曲線

由圖3可見：各陰極電勢(shì)條件下CV曲線中的電流值均比對(duì)照組的要大，表明電化學(xué)功能微生物在陰極發(fā)生了還原反應(yīng)；在陰極電勢(shì)為-0.70 V時(shí)，電流值最大，電流密度最大，且在-0.62 V附近出現(xiàn)了還原峰，該還原峰出現(xiàn)的位置與之前HAWKINS等［14］報(bào)道的結(jié)果相似；隨著陰極電勢(shì)的改變，MES陰極還原CO2的還原峰出現(xiàn)的位置差別不大，表明陰極電勢(shì)的差異對(duì)MES還原CO2的還原電位幾乎沒有影響；但是不同陰極電勢(shì)下CV曲線對(duì)應(yīng)的曲線面積相差較大，通過CV計(jì)算反應(yīng)完成后電極的電容效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，陰極電勢(shì)-0.80，-0.70，-0.60，-0.50，-0.40 V下的電容分別為0.542，0.673，0.439，0.374，0.288 F，與對(duì)照組（0.065 F）相比，外加電勢(shì)組的電容提高了約3.4～9.4倍，這說(shuō)明施加外加電勢(shì)后，陰極電容有了極大的提高。對(duì)比不同陰極電勢(shì)條件下的陰極電容發(fā)現(xiàn)，在-0.70 V的條件下電勢(shì)電容最大。電極電容越大，表明生物陰極比表面積越大，陰極生物的活性表面積得到了提升，從而提高了MES的合成轉(zhuǎn)化效率。

2.4 SEM結(jié)果分析

MES陰極表面的SEM照片見圖4。由圖4可見：MES陰極碳?xì)掷w維表面不同程度附著微生物，微生物緊密吸附在碳?xì)掷w維的表面，說(shuō)明電極材料具有良好的生物親和性。

圖4 MES陰極表面的SEM照片

2.5 微生物菌群高通量測(cè)序分析

陰極生物膜細(xì)菌在屬水平上的分布情況見圖5。由圖5可見：醋桿菌（Acetobacteriumsp.）、假絲酵母菌（Candidasp. S）、地桿菌（Geobactersp.）等在各電勢(shì)條件下豐度均相對(duì)較高，為優(yōu)勢(shì)菌群；未馴化污泥中甲烷菌（Methanothrixsp.）的豐度為13%，其次是變形桿菌（Proteussp.）11%、醋桿菌10%、大腸桿菌（Escherichiasp.）10%、假絲酵母菌8%；而在不同電勢(shì)強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)組中均未檢測(cè)到甲烷菌，這是因?yàn)樵隈Z化之前加入了甲烷抑制劑，抑制了與其他菌種競(jìng)爭(zhēng)電子的產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)，這樣能使反應(yīng)向著更益于合成有機(jī)酸的方向進(jìn)行［15］。醋桿菌是一種產(chǎn)乙酸菌，它可以利用H2和CO2生成乙酸［16］。對(duì)比外加電勢(shì)和無(wú)電勢(shì)的MES發(fā)現(xiàn)，在外加電勢(shì)條件下假絲酵母菌生長(zhǎng)更為旺盛，其豐度在不同電勢(shì)條件下均有明顯提升，可能的原因是假絲酵母菌可以捕捉電子，一方面用于自身細(xì)胞生長(zhǎng)代謝，另一方面消耗底物合成相應(yīng)產(chǎn)物。

圖5 陰極生物膜細(xì)菌在屬水平上的分布情況

由圖5還可見：陰極電勢(shì)為-0.40 V的條件下，醋桿菌（Acetobacteriumsp.）的豐度為13%，假絲酵母菌（Candidasp. S）的豐度為12%，地桿菌（Geobactersp.）的豐度相對(duì)較低，只有7%；隨著陰極電勢(shì)的降低，這3種優(yōu)勢(shì)菌在屬水平上的豐度均有明顯提高，在電勢(shì)條件為-0.70 V時(shí)，3種優(yōu)勢(shì)菌豐度之和相對(duì)整個(gè)菌群占比最大，醋桿菌（Acetobacteriumsp.）為33%、假絲酵母菌（Candidasp. S）為23%、地桿菌（Geobactersp.）為14%，在此條件下MES中有機(jī)酸的積累量最多，可能的原因是這些細(xì)菌可以通過特殊途徑建立互利共生的關(guān)系，營(yíng)造出一種共養(yǎng)的環(huán)境，微生物之間的協(xié)同作用使得混合菌群能在電勢(shì)的作用下合成有機(jī)酸，這與之前的報(bào)道一致［17］；而在-0.80 V條件下，醋桿菌（Acetobacteriumsp.）的豐度為28%、假絲酵母菌（Candidasp. S）為22%、地桿菌（Geobactersp.）為12%，相比-0.70 V條件下略有降低，這表明優(yōu)勢(shì)菌的最適電勢(shì)為-0.70 V，一旦超過最適宜的電勢(shì)條件反而不利于微生物的生長(zhǎng)?？刂坪眉?xì)菌生長(zhǎng)的最適電勢(shì)，是提高M(jìn)ES還原CO2合成有機(jī)物的關(guān)鍵。

3 結(jié)論

a）采用3電極體系H型雙室反應(yīng)器建立MES，還原CO2合成有機(jī)物。陰極電勢(shì)從-0.40 V降至-0.70 V時(shí)，甲酸積累量從0.774 mmol/L增加到1.554 mmol/L；當(dāng)降至-0.80 V時(shí)，甲酸積累量降為1.467 mmol/L。電勢(shì)為-0.70 V時(shí)，乙酸積累量最大，為2.754 mmol/L。

b）整個(gè)系統(tǒng)陰極的總庫(kù)倫效率變化范圍為41.07%～81.42%，其中有機(jī)酸的庫(kù)倫效率為39.23%～75.80%。陰極電勢(shì)為-0.70 V時(shí)總庫(kù)倫效率最大，為81.42%；-0.40 V時(shí)最小，為41.07%。

c）在陰極電勢(shì)為-0.7 0 V時(shí)，醋桿菌（Acetobacteriumsp.）、假絲酵母菌（Candidasp. S）、地桿菌（Geobactersp.）3種菌在陰極生物膜上占比最大，為優(yōu)勢(shì)菌種，豐度分別為33%，23%，14%。