杜曉鵬 毛愛(ài)國(guó) 徐 陶 王翠萍 謝寶澤 張明飛 王 雄 黨西鋒 卓丙德 蔣輝軍 朱文靜 張俊森

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染引起的一種致死性人獸共患病，病死率幾乎高達(dá)100%。目前，對(duì)狂犬病尚無(wú)有效的治療方法，及時(shí)接種疫苗是預(yù)防狂犬病的最有效措施之一。

全世界所有報(bào)告的動(dòng)物狂犬病病例中約有95%是在犬，超過(guò)90%的人死亡歸因于狂犬病犬，大規(guī)模疫苗接種是犬狂犬病防治的主要方法。犬的狂犬病免疫覆蓋率低于70%是誘發(fā)人間狂犬病發(fā)生的主要原因，2017年全國(guó)共報(bào)告502例人狂犬病死亡病例，狂犬病疫情呈整體下降趨勢(shì)，但是我國(guó)西南地區(qū)的廣西、云南、四川和貴州四省依然是我國(guó)人和動(dòng)物狂犬病高發(fā)省份，僅華南地區(qū)的海南省為我國(guó)低發(fā)省份。

為了解我國(guó)南方地區(qū)的警犬狂犬病疫苗免疫效果，分析影響警犬免疫合格率的因素，2017～2018年對(duì)西南地區(qū)狂犬病高發(fā)省份廣西、云南、四川和貴州，以及華南地區(qū)低發(fā)省份海南省五省部分地區(qū)警犬狂犬病血清中和抗體進(jìn)行調(diào)查，隨機(jī)抽樣342頭警犬，有效樣本342份，采用熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FAVN），檢測(cè)血清中RABV血清中和抗體效價(jià)。

一、調(diào)查對(duì)象

根據(jù)抽樣地區(qū)警犬工作布局情況，選取云南、貴州、四川、廣西、海南五省部分地區(qū)進(jìn)行抽樣。按照7月齡以上訓(xùn)練犬與工作犬總數(shù)量的10%進(jìn)行抽樣：每個(gè)性別組按照10%的比例進(jìn)行間隔抽樣；當(dāng)超過(guò)20頭時(shí)，可按照隔2抽1、隔3抽1的原則抽樣，以此類(lèi)推。共選取警犬342頭，為訓(xùn)練犬和工作犬，身體健康。

（一）范圍

云南選取昆明、楚雄某訓(xùn)練場(chǎng)56頭警犬，貴州選取貴陽(yáng)某訓(xùn)練場(chǎng)60頭警犬，四川選取成都、綿陽(yáng)、德陽(yáng)、瀘州四個(gè)訓(xùn)練場(chǎng)71頭警犬，廣西選取南寧、桂林、梧州、玉林93頭警犬，海南選取?？凇⑷齺?、萬(wàn)寧、陵水、保亭、瞻洲、澄邁等62頭警犬，總共342頭。

（二）警犬免疫程序與免疫覆蓋率

1. 警犬免疫程序 3月齡時(shí)進(jìn)行1次狂犬病滅活疫苗注射，以后每年注射1次；1歲以上的犬，每年進(jìn)行1次狂犬病滅活疫苗注射。5個(gè)省（區(qū)）都對(duì)轄區(qū)單位開(kāi)展警犬訓(xùn)練培訓(xùn)工作，幼犬在6月齡左右進(jìn)行訓(xùn)練，3～6月后訓(xùn)練結(jié)束，由上述訓(xùn)練單位調(diào)至新的工作單位，狂犬病免疫程序并入新單位的年度免疫。

疫苗：云南、貴州選用疫苗為A品牌（Pasteur RIV株，至少2IU），定義為A組；四川選用B品牌（HCP-SAD株，滅活前不少于106.3FAID50/mL），定義為B組；南寧、桂林、玉林均使用A疫苗；梧州使用A疫苗、B疫苗和C疫苗（Rb/E3株≥105.0LD50/0.03ml）、D疫苗（G52株，每頭份至少為1IU），后兩種疫苗分別定義為C組、D組。

2. 經(jīng)查閱檔案調(diào)查，南方5省的警犬狂犬病疫苗免疫覆蓋率為100%。

（三） 檢測(cè)犬種 包括德國(guó)牧羊犬、馬里努阿犬、昆明犬、羅威納犬、拉布拉多犬、史賓格犬、尋血獵犬、維茲拉犬與昆馬雜交犬，按照中國(guó)工作犬管理協(xié)會(huì)的犬種分組表，將檢測(cè)犬分為大型犬（55cm以上）、中型犬（35.1-54.9cm）與小型犬（35cm以下）。本研究中德國(guó)牧羊犬、馬里努阿犬、昆明犬、羅威納犬、尋血獵犬與昆馬雜交犬屬于大型犬，拉布拉多犬、史賓格犬與維茲拉犬屬于中型犬。

（四） 采樣 2016～2018年完成南方5省的警犬采樣工作，檢測(cè)犬覆蓋了上述地區(qū)所有訓(xùn)練犬與工作犬，檢測(cè)犬的采樣時(shí)間為最近一次免疫后28天的各個(gè)時(shí)間段，所有數(shù)據(jù)均為橫斷面采集。

二、 材料與方法

（一）待檢血清：在警犬狂犬病滅活疫苗免疫后28天，從待檢犬前肢頭靜脈采血至少3mL，靜置2小時(shí)，1500rmp/min離心30min，分離血清，冷凍保存或冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，備用。出現(xiàn)溶血需重新采取血樣并分離血清。

（二）檢測(cè)試劑

1.標(biāo)準(zhǔn)血清：購(gòu)自法國(guó)歐盟狂犬病血清學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室，效價(jià)為5.92IU/mL。

2. 陰性血清：采集自未免疫健康犬，由軍事獸醫(yī)研究所世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）狂犬病參考實(shí)驗(yàn)制備。

3.熒光抗體：FITC熒光素標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體購(gòu)自Fujiribio公司。

4. 狂犬病病毒CVS-11細(xì)胞毒：軍事獸醫(yī)研究所保存，滴度為106.67TCID50/mL。

（三）檢測(cè)方法

1. 樣本處理：待檢血清分別在56℃滅活30min。

2. 檢測(cè)：采用OIE《陸生動(dòng)物診斷測(cè)試和免疫手冊(cè)》2013版直接免疫熒光病毒中和試驗(yàn)（FAVN）對(duì)待檢血清中RABV中和抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。首先對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清和待檢血清進(jìn)行3倍梯度稀釋?zhuān)♂寘^(qū)域第1列各孔內(nèi)預(yù)先加入100μL培養(yǎng)液，每孔加入血清50μL，混勻后吸取50μL加入第2列，依此稀釋。取預(yù)先確定滴度的狂犬病病毒CVS-11，以MEM培養(yǎng)液稀釋至30-300TCID50/50μL，除細(xì)胞及培養(yǎng)液對(duì)照孔外每孔加入50μL，置37℃中和60min。BHK-21細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、分散、計(jì)數(shù)，稀釋至4×105/mL，除培養(yǎng)液對(duì)照孔外每孔加入50μL細(xì)胞懸液，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入50μL冷丙酮-20℃固定細(xì)胞1h，PBST洗滌后，將狂犬病病毒核蛋白熒光抗體稀釋至工作濃度，每孔加入50μL工作液，37℃孵育1h。PBST洗滌，熒光顯微鏡下觀察每個(gè)孔，孔內(nèi)有熒光細(xì)胞即記為感染，為陽(yáng)性；無(wú)熒光細(xì)胞為完全中和，為陰性。基于Spearman-Karber公式的推導(dǎo)公式計(jì)算待檢血清RABV中和效價(jià)。

以犬免疫后血清RABV中和抗體效價(jià)≥0.50IU/mL為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到或超過(guò)0.50IU/mL即具有效保護(hù)水平。

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

檢測(cè)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0及Excel2007進(jìn)行分析處理。

表1 342頭警犬RABV中和抗體檢效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

表2 不同年齡的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

表3 不同免疫次數(shù)的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

三、結(jié)果與分析

（一） 342頭警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表1。342頭警犬中和抗體陽(yáng)性230頭，整體免疫合格率為67.25%。其中，四川地區(qū)免疫合格率最高，為76.06%；云南最低，為57.14%。分析顯示：四川的免疫合格率與云南、廣西、貴州3個(gè)地區(qū)免疫合格率之間差異顯著（P＜0.05），與海南之間差異不顯著。

表4 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果 單位：份

表5 不同體型的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

表6 不同性別的警犬RABV中和效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

（二） 不同年齡的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表2。將342頭警犬分成3～6月齡犬、7～12月齡、13～24月齡、2～6歲、6歲以上5個(gè)年齡組，各個(gè)年齡段的免疫合格率分別為56.14%、39.13%、68.42%、76.80%、78.95%。分析表明：1歲以上的犬免疫合格率明顯高于1歲以下犬，它們之間差異極顯著（P＜0.01）；7～12月齡犬的免疫合格率明顯低于其他年齡段的犬，差異極顯著（P＜0.01）。

（三） 不同免疫次數(shù)的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表3。對(duì)342頭警犬，按照不同的免疫次數(shù)進(jìn)行分組，數(shù)據(jù)顯示：免疫1次以上的警犬免疫合格率明顯高于免疫1次的警犬，免疫1次的警犬合格率僅為49.60%。分析顯示，免疫1次的免疫合格率與免疫2～3次之間差異極顯著（P＜0.01），免疫1次的免疫合格率與免疫4次及4次以上之間差異極顯著（P＜0.01）。

（四） 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表4。結(jié)果顯示：云南、貴州、廣西和海南大多選用A組疫苗，四川選用B組疫苗；廣西梧州個(gè)別單用選用C組與D組疫苗，警犬?dāng)?shù)量分別為2頭與1頭，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)于C組與D組疫苗的免疫效果不做分析。分析發(fā)現(xiàn)：云南、貴州、廣西和海南使用的A組疫苗，免疫合格率為65.53%，四川選用的B組疫苗免疫，合格率為76.06%，高于云南、貴州、廣西和海南的免疫效果，A組疫苗和B組疫苗之間差異顯著（P＜0.05）。

（五） 不同體型犬種的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表5。本次檢測(cè)警犬為中型犬和大型犬，從結(jié)果看出：中型犬的免疫合格率為65.12%，大型犬的免疫合格率為67.97%，兩者之間差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明在中型犬與大型犬中，體型大小對(duì)免疫合格率無(wú)影響。

（六） 不同性別的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表6。結(jié)果顯示：檢測(cè)的公犬與母犬，其免疫合格率為67.37%（128/190），母犬的合格率為67.11%（102/152），兩者之間沒(méi)有差異，說(shuō)明警犬的性別對(duì)狂犬病疫苗免疫合格率沒(méi)有影響。

（七） 不同采樣時(shí)間的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果。342頭警犬的采樣時(shí)間分別為最后一次免疫后的14d、34d、60d、90d、120d、180d、270d、300d、330d和360d，其免疫合格率見(jiàn)表7。在免疫后14d內(nèi)采樣，其免疫合格率可以達(dá)到92.86%（13/14）；而在免疫后90d采樣，其免疫合格率將出現(xiàn)下降，說(shuō)明在免疫后90d，血清中和抗體將出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

表7 不同采樣時(shí)間的警犬RABV中和效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

四、 討論

（一）本次檢測(cè)通過(guò)橫斷面數(shù)據(jù)分析云南、貴州、四川、廣西和海南五省部分地區(qū)警犬的RABV中和抗體水平，342頭檢測(cè)警犬，陽(yáng)性230份，免疫合格率為67.25%。說(shuō)明警犬的狂犬病疫苗免疫效果無(wú)法達(dá)到100%的保護(hù)作用，需加強(qiáng)南方五省警犬狂犬病疫苗接種工作。

（二） 在我國(guó)狂犬病高發(fā)省份與低發(fā)省份，按照現(xiàn)行的警犬狂犬病疫苗免疫程序，其免疫合格率接近，沒(méi)有出現(xiàn)與國(guó)內(nèi)狂犬病疫情流行相似的規(guī)律。說(shuō)明對(duì)犬進(jìn)行狂犬病疫苗接種，可保證犬的免疫合格率，應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)警犬的狂犬病疫苗接種工作。

（三） 警犬的免疫合格率與年齡成正相關(guān)。本次檢測(cè)1歲以下的警犬免疫合格率39.13～56.14%，1歲以上的均超過(guò)70%。這與Kennedy等人的研究結(jié)果相同，年齡較小的犬由于免疫系統(tǒng)不健全，接種疫苗的效果較差。

（四） 警犬的免疫合格率與免疫次數(shù)密切相關(guān)。本次檢測(cè)將免疫次數(shù)分為免疫1次、免疫2～3次、免疫4次及以上3個(gè)組別，其免疫合格率分別為49.60%、78.49%、77.05%。數(shù)據(jù)顯示：免疫2次及以上的警犬免疫合格率明顯高于免疫1次（P＜0.01），說(shuō)明免疫次數(shù)越多，免疫合格率越高。Tk S的調(diào)查顯示，連續(xù)多次接種狂犬病疫苗的犬比只接種1次疫苗的犬具有更好的抗體滴度。

（五）對(duì)于大型犬與中型犬，警犬的體型大小對(duì)免疫合格率影響不大。本次檢測(cè)中，沒(méi)有出現(xiàn)小型犬，檢測(cè)的大型犬與中型犬的免疫合格率分別為67.97%、65.12%，兩者之間差異不顯著；檢測(cè)犬種僅出現(xiàn)1頭雜交犬（大型犬），其檢測(cè)結(jié)果不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)Berndtsson LT等人報(bào)道，中大型純種犬免疫效果不如小型犬或雜交犬，體型較小的犬比體型較大的犬能產(chǎn)生更高的抗體水平。這可能的原因是相同劑量的疫苗，體型越小，抗體反應(yīng)就越強(qiáng)。

（六）警犬的性別對(duì)免疫合格率沒(méi)有影響。本次檢測(cè)結(jié)果與Mansfield KL等人、JAKEL等人的研究結(jié)果一致，說(shuō)明犬的性別對(duì)抗體應(yīng)答沒(méi)有影響。

（七） 不同種類(lèi)的疫苗種對(duì)免疫合格率有影響。不同種類(lèi)疫苗，免疫合格率之間存在差異，這是否與疫苗毒株型，以及抗原含量、所用佐劑的濃度和完整性有關(guān)，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

（八） 不同采樣時(shí)間對(duì)免疫合格率的影響。本次橫斷面的數(shù)據(jù)顯示，在免疫后不同時(shí)間采樣，免疫合格率存在明顯差異。免疫后14d內(nèi)采樣，其免疫合格率可達(dá)92.86%，而在免疫后90d采樣，免疫合格率將出現(xiàn)下降趨勢(shì)。Kennedy 報(bào)道了在免疫后30d采樣，免疫合格率最高，隨著采樣時(shí)間的延續(xù)，未達(dá)到抗體應(yīng)答點(diǎn)的犬的比例也在增加。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)AVN的最高通過(guò)率出現(xiàn)在犬接種后1～4周，這與本次檢測(cè)結(jié)果相似。

（九） 免疫失敗是導(dǎo)致免疫合格率低的重要原因。本次檢測(cè)中，某警犬訓(xùn)練單位的10頭3～7歲的全部檢測(cè)警犬，檢測(cè)結(jié)果均低于0.50IU/mL，這對(duì)整個(gè)抽檢地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果造成影響。有研究證明：犬的中和抗體水平與免疫次數(shù)成正比，免疫次數(shù)越多，抗體水平越高。按照規(guī)定的警犬免疫程序至少有3～7次的狂犬病疫苗接種史，結(jié)果不應(yīng)該全部不合格。低水平的不合格檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明：該單位過(guò)去幾年的狂犬病免疫屬于免疫失敗，應(yīng)查找原因，盡快加強(qiáng)狂犬病疫苗接種。

五、 結(jié)論與建議

（一） 本次橫斷面數(shù)據(jù)分析顯示，我國(guó)南方五省警犬狂犬病防控工作存在不足，應(yīng)加強(qiáng)狂犬病疫苗接種工作，杜絕免疫失??；狂犬病高發(fā)省份與低發(fā)省份的警犬狂犬病防控工作，沒(méi)有出現(xiàn)與國(guó)內(nèi)狂犬病疫情流行相似的規(guī)律。警犬的免疫合格率與年齡成正相關(guān)，與免疫次數(shù)關(guān)系密切，免疫次數(shù)越多，免疫合格率越高；警犬的免疫合格率與采樣時(shí)間、疫苗種類(lèi)有關(guān)，與犬的性別沒(méi)有關(guān)系；對(duì)于大型犬和中型犬，體型大小對(duì)免疫合格率影響不大。

（二） 隨著警犬社會(huì)化訓(xùn)養(yǎng)工作的加強(qiáng)和“民犬警用”工作的延伸，應(yīng)從警犬的“入口”加強(qiáng)狂犬病防控工作。據(jù)我們對(duì)云南某犬場(chǎng)社會(huì)化訓(xùn)養(yǎng)區(qū)域農(nóng)戶(hù)家養(yǎng)犬及散養(yǎng)犬、流浪犬的監(jiān)測(cè)，其血清中和抗體水平合格的不足20%，若該區(qū)域有狂犬病野毒存在，將威脅社會(huì)化訓(xùn)養(yǎng)區(qū)域的警犬。

（三） 完善《警犬疾病防治工作規(guī)則》。其中規(guī)定“警犬3月齡時(shí)進(jìn)行1次狂犬病滅活疫苗注射，以后每年注射1次”。本次調(diào)查，警犬在12月齡前免疫合格率普遍偏低，尤其是7～12月齡的警犬。作者在“云南某犬場(chǎng)犬狂犬病滅活疫苗免疫抗體效價(jià)評(píng)估”中，同樣發(fā)現(xiàn)12月齡以下警犬免疫合格率僅為9.68%。建議規(guī)則修改為“警犬3月齡時(shí)進(jìn)行第1次狂犬病滅活疫苗注射，28天后進(jìn)行第2次狂犬病滅活疫苗免疫，以后每年注射1次”。

（四） 規(guī)范警犬狂犬病滅活疫苗免疫工作，嚴(yán)格執(zhí)行公安部頒發(fā)的《警犬疾病防治工作規(guī)則》，包括疫苗的采購(gòu)、運(yùn)輸、保存及注射工作。

（五） 加強(qiáng)帶犬人員狂犬病的預(yù)防和保護(hù)工作，對(duì)每個(gè)新從業(yè)人員進(jìn)行狂犬病防護(hù)知識(shí)培訓(xùn)。

（六） 有條件的單位可以開(kāi)展警犬狂犬病滅活疫苗免疫效果監(jiān)測(cè)工作，監(jiān)測(cè)方法包括：狂犬病抗體測(cè)試板、ELISA檢測(cè)法、熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FAVN）等。