劉松奇 戢得蓉 段麗麗

(四川旅游學(xué)院，四川 成都 610100)

百香果，又名西番蓮，原產(chǎn)于熱帶非洲，其果籽含有豐富的油脂及其他功能性成分。已有對(duì)百香果種籽中總黃酮的體內(nèi)抗氧化活性的研究發(fā)現(xiàn)其抗氧化性效果顯著，百香果籽油可以作為開(kāi)發(fā)保健型食品的備選材料。利用百香果籽含油量高的特點(diǎn)，選擇合適的方式提取其油脂，是目前對(duì)百香果籽研究的一大熱點(diǎn)。

目前常見(jiàn)的從種籽中提取油脂的方法有傳統(tǒng)壓榨法、索氏提取法、超聲波(微波)輔助提取法[1-2]、水蒸氣蒸餾法、超臨界二氧化碳提取法[3]、冷壓法結(jié)合固相微萃取分離法等[4]。比較壓榨法、浸出法、超臨界法、水代法及水酶法提取茶油發(fā)現(xiàn)水酶法及水代法提取的油脂品質(zhì)均優(yōu)于其他方法[5]。與溶劑法、壓榨法相比，水酶法不會(huì)改變油脂的脂肪酸組成，毛油質(zhì)量更有利于后續(xù)精煉工藝的指標(biāo)特征，與水劑法相比，水酶法可以提高油脂VE的含量與氧化穩(wěn)定性[6]。水酶法相對(duì)于其他方法，具有安全、綠色、高效的特點(diǎn)，同時(shí)具有條件溫和、能耗較低、污染少、廢物易處理等優(yōu)點(diǎn)，所提取的油脂品質(zhì)也較高。

本研究采用水酶法提取百香果籽油，利用混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合酶的配比、響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝、DPPH法初步評(píng)價(jià)此方法所提百香果籽油的抗氧化性。將百香果籽油脂進(jìn)行提取，既豐富了百香果籽的應(yīng)用，又豐富了油脂的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

百香果紫果：湖南邵陽(yáng)市；山核桃油：遼寧晟麥實(shí)業(yè)股份有限公司；橄欖油：哈爾濱普潤(rùn)油脂有限公司；酸性蛋白酶、糖化酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶及葡聚糖酶：河南慶飛食品配料有限公司；氫氧化鉀、異丙醇、無(wú)水乙醚、無(wú)水乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯、酚酞、堿藍(lán)6B、冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉、重鉻酸鉀、正己烷、鹽酸分析純、DPPH：梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

Scout SE型電子天平：奧豪斯儀器(常州)有限公司；DFY-400搖擺式粉碎機(jī)：溫嶺市大德藥機(jī)有限公司；H2050R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；101-0A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；STARTER 3100型pH計(jì)：奧豪斯儀器(上海)有限公司；UV BlueStar A紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝

將干燥的百香果籽于105℃烘干至恒重，后用高速粉碎機(jī)進(jìn)行破壁粉碎并混合均勻，稱量10g粉碎后的百香果籽，加入一定量的水，混合均勻后調(diào)節(jié)pH，添加酶后搖勻，酶解一段時(shí)間后，將酶解容器置于90℃滅酶20min，然后冷卻至室溫后置于-18℃凍藏20h，凍藏結(jié)束后置于40℃解凍2h，解凍后離心(9000r/min,20min)后吸取上層清油，低溫烘干至質(zhì)量恒定，計(jì)算百香果籽油提油率。

1.2.2 提油率的計(jì)算

百香果籽油提取率：

w(%)=[m2/(m1×B)]×100%

(1)

式(1)中：B為百香果籽的總脂肪量/%，m1為稱取粉碎后百香果籽總質(zhì)量/g，m2為提取得到百香果籽油的質(zhì)量/g。

1.2.3 酶種類的篩選

百香果籽細(xì)胞壁主要是粗纖維構(gòu)成，而水酶法主要是通過(guò)酶破壞油脂與蛋白質(zhì)(糖類)結(jié)合形成的復(fù)合物來(lái)達(dá)到釋放油脂，提高提油率的目的?？疾?種酶(最適pH值，最適溫度/℃)：果膠酶(3.5，50℃)，糖化酶(4.0～4.5，60℃～62℃)，酸性蛋白酶(3.0，40℃)，中性蛋白酶(6.9，48℃)，堿性蛋白酶(8.0，50℃)，纖維素酶(4.8，50℃)，木瓜蛋白酶(6.5，60℃)及葡聚糖酶(4.2，60℃)對(duì)百香果籽油提油率的影響。分別在所選8種酶的最適pH值、最適宜溫度條件下，以相同的料液比(1∶3)、酶用量(2%)酶解相同的時(shí)間(6h)進(jìn)行提取，計(jì)算不同酶酶解后的百香果籽油的提取率。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

其他條件相同的前提下，分別探討pH值(4.5、5、5.5、6、6.5)，酶解溫度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)，酶制劑用量(1%、2%、3%、4%、5%)，酶解時(shí)間(3h、4h、5h、6h、7h)，料液比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)5個(gè)因素對(duì)提油率的影響。

1.2.5 混料實(shí)驗(yàn)優(yōu)化分析

采用Design Expert10.0.4設(shè)計(jì)混料實(shí)驗(yàn)，以葡聚糖酶添加比例(A)、木瓜蛋白酶添加比例(B)、糖化酶添加比例(C)為自變量，百香果籽油提油率為響應(yīng)值，并把3種酶的添加比均限定在(0.1～0.8)且A+B+C=1(100%)。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化分析

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以百香果籽提油率為響應(yīng)值，選取酶制劑用量、酶解溫度、pH值這三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[7]。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.2.7 理化指標(biāo)測(cè)定

粗脂肪測(cè)定參考NY/T 4-1982《谷類、油料作物種子粗脂肪測(cè)定》；酸價(jià)測(cè)定參考GB 5009.229-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》；過(guò)氧化值測(cè)定參考GB 5009.227-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》；皂化值參考GB/T 5534-2008《動(dòng)植物油脂 皂化值的測(cè)定》；油脂質(zhì)量評(píng)價(jià)參考GB 2716-2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物油》。

紫外測(cè)定：將百香果籽油配制成1g/100ml正己烷溶液，于270nm～900nm波長(zhǎng)處測(cè)其紫外吸收光譜。

1.2.8 DPPH自由基清除率的測(cè)定

用無(wú)水乙醇配制0.10mmol/L DPPH溶液，用乙酸乙酯配制不同濃度的樣品液(5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL),在比色皿中分別加入試劑與樣品液，混勻后于517nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率：

S(%)=[C-(A-B)]/C

(2)

式(2)中：A為2mL DPPH溶液+2mL樣品液，B為2mL無(wú)水乙醇+2mL樣品液，C為2mL DPPH溶液+2mL樣品溶劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與處理

所有實(shí)驗(yàn)平行三次及以上，數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的種類對(duì)提油率的影響

選取8種酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果如圖1，提油率最好的3種酶制劑是堿性蛋白酶、酸性蛋白酶以及木瓜蛋白酶。但是堿性蛋白酶與酸性蛋白酶分別在偏強(qiáng)堿和偏強(qiáng)酸條件才能體現(xiàn)其活力，而油脂在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿條件下遇較高溫度會(huì)較快水解，不利于油脂的穩(wěn)定性[8]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果及酶的專一性，使用復(fù)合酶提取油脂，總提取率會(huì)稍高，同時(shí)為節(jié)約成本，選取pH以及酶解溫度相近的酶進(jìn)行復(fù)配，利用混合酶提高提油率，所以將木瓜蛋白酶、糖化酶及葡聚糖酶進(jìn)行復(fù)配，初步采用添加比例為1∶1∶1。

圖1 不同酶作用下百香果籽油的提油率

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH對(duì)提油率的影響

在60℃酶解溫度、酶制劑(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量為3.5%、料液比為1∶3條件下酶解6h，研究不同pH條件對(duì)提油率的影響，結(jié)果如圖2。pH對(duì)百香果籽油的提取有顯著影響，提油率隨著酶解pH的升高先增加后減小，在pH為5.5時(shí)達(dá)到38%。這可能與復(fù)合酶的最適酶解pH值有關(guān)，pH的改變影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離，從而降低酶與原料的結(jié)合力，降低油脂的釋放。

圖2 不同pH作用下百香果籽油的提油率

2.2.2 溫度對(duì)提油率的影響

在相同的pH值為5.5、酶制劑(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量為3.5%、料液比為1∶3條件下酶解6h，考察溫度的改變對(duì)提油率的影響，結(jié)果如圖3。溫度由45℃升到55℃時(shí)，提油率迅速上升，在55℃提油率達(dá)到最高。溫度上升提油率下降是由于一般情況下環(huán)境溫度每升高10℃，酶解速度就增快一倍左右[9]，直到酶解速度達(dá)到相對(duì)最大值，后期溫度繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)逐漸發(fā)生變性，導(dǎo)致酶失去活性，提油率逐漸降低。

圖3 不同溫度作用下百香果籽油的提油率

2.2.3 酶制劑用量對(duì)提油率的影響

在pH值為5.5、酶解溫度為55℃、料液比為1∶3條件下酶解6h，考察酶制劑(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量對(duì)提油率的影響，結(jié)果如圖4。酶制劑添加量從1%增加到4%的這個(gè)過(guò)程中，提油率逐步提高。但是超過(guò)4%之后，提油率開(kāi)始出現(xiàn)下降現(xiàn)象，這可能是因?yàn)槊傅母?jìng)爭(zhēng)性抑制作用降低酶解的效率。

圖4 不同酶制劑用量百香果籽油的提油率

2.2.4 料液比用量對(duì)提油率的影響

在pH值為5.5、酶解溫度為55℃、酶制劑(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量為4%條件下酶解6h，考察料液比對(duì)提油率的影響，結(jié)果如圖5。當(dāng)料液比在從1∶2到1∶3，提油率迅速提高，可能是因?yàn)殡S著水分的增加，增大了酶與底物的擴(kuò)散，使兩者充分接觸，然而1∶3之后提油率開(kāi)始下降，可能因?yàn)榇罅克纸档土嗣概c底物的濃度，使兩者的碰撞率下降，從而降低提油率。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)提油率的影響

在pH值為5.5、酶解溫度為55℃、料液比為1∶3、酶制劑(糖化∶木瓜∶葡聚=1∶1∶1)用量為4%條件下考察酶解時(shí)間對(duì)提油率的影響，結(jié)果如圖6所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加提油率也逐漸增加，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到6h時(shí)得到最大提油率，隨后漸漸穩(wěn)定，由此可推測(cè)時(shí)間的增加，底物濃度逐漸減少，當(dāng)達(dá)到6h時(shí)酶解基本結(jié)束，考慮到能源消耗問(wèn)題選擇6h為宜。

圖6 不同酶解時(shí)間下百香果籽油的提油率

2.3 酶解法提取百香果籽油的混料實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果下，以葡聚糖酶添加比例(A)、木瓜蛋白酶添加比例(B)、糖化酶添加比例(C)為特征值，提油率為響應(yīng)值，進(jìn)行混料實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2。

表2 混料實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert 10.0.4軟件，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到提油率與葡聚糖酶(A)、木瓜蛋白酶(B)、糖化酶(C)的多元線性回歸方程：提油率=+31.49A+40.78B+35.74C-37.28AB-7.32AC+4.1BC-28.6ABC+116.75AB(A-B)-66.7AC(A-C)+0BC(B-C)。對(duì)以上回歸模型進(jìn)行方差分析，詳見(jiàn)表3。

回歸方程中由F分布來(lái)檢驗(yàn)響應(yīng)面的顯著性，概率P值越小，對(duì)應(yīng)自變量顯著性越好。由表3得出，提油率模型總回歸項(xiàng)為顯著(P=0.016 5<0.05)，失擬性不顯著(P=0.424 0>0.05)說(shuō)明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，即該回歸模型擬合度好，實(shí)驗(yàn)誤差比較小。校正決定系數(shù)Adj.R2是0.816 0，表示模型擬合較好。CV值是6.59%，說(shuō)明該回歸模型的數(shù)據(jù)精確度較高。性噪比AP為7.912大于4，說(shuō)明模型的可行度比較高。決定系數(shù)R2為0.929 2，說(shuō)明二次項(xiàng)模型中估測(cè)值與實(shí)驗(yàn)真實(shí)值之間的相關(guān)性可達(dá)92.92%。

表3 混料實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

注：P<0.05表示差異顯著，標(biāo)注為*；P<0.01表示差異極顯著標(biāo)注為**。

復(fù)合酶的配比對(duì)提油率交互影響的三維圖、等高線圖形如圖7。當(dāng)葡聚糖酶用量較多，木瓜蛋白酶與糖化酶用量較少時(shí)，提油率在30%左右。而當(dāng)木瓜蛋白酶或糖化酶用量較多，另外兩種酶用量較少時(shí)，提油率均能達(dá)到40%。3種酶在酶解過(guò)程中，木瓜蛋白酶與糖化酶均能起到主導(dǎo)作用，同時(shí)三維圖的曲面說(shuō)明酶與酶之間有交互作用，3種酶適宜的配比混合后產(chǎn)生協(xié)同作用顯著提高提油率。最佳配比為木瓜蛋白酶∶葡聚糖酶∶糖化酶=0.8∶0.1∶0.1。

2.4 酶解法提取百香果籽油的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以pH(A)、溫度(B)、酶制劑用量(C)等影響因素為特征值，響應(yīng)值為提油率，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert 10.0.4軟件，對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到提油率與酶解pH值(A)、酶解溫度(B)、酶制劑用量(C)的多元線性回歸方程：提油率=+48.90+6.00A+3.13B-1.50C-6.63AB+8.88AC-3.88BC-2.89A2-2.14B2-5.89C2。對(duì)以上回歸模型進(jìn)行方差分析，詳見(jiàn)表5。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

注：P<0.05表示差異顯著，標(biāo)注為*；P<0.01表示差異極顯著標(biāo)注為**。

由表5可知，校正決定系數(shù)Adj.R2是0.880 8，預(yù)測(cè)復(fù)相關(guān)系數(shù)Pred.R2為0.761 3說(shuō)明模型擬合較好。性噪比AP為12.884大于4，說(shuō)明模型的可行度比較高。決定系數(shù)R2為0.947 8，說(shuō)明二次項(xiàng)模型中估測(cè)值與實(shí)驗(yàn)真實(shí)值之間的相關(guān)性可達(dá)94.78%。

各因素交互作用對(duì)百香果籽油提油率的影響見(jiàn)圖8，酶用量與溫度的交互作用對(duì)百香果籽油的提油率影響顯著，酶解溫度與pH值、酶制劑用量與pH值的交互作用對(duì)百香果籽油的提油率影響極顯著。酶解溫度在50℃、酶制劑用量為4.96%、pH=6時(shí)提油率最高，可達(dá)58.75%。在最優(yōu)條件下，進(jìn)行平行三次實(shí)驗(yàn)。結(jié)果分別為57.00%、56.96%、59.02%，提油率平均分值與預(yù)測(cè)值相對(duì)偏差小于5%，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，說(shuō)明回歸方程具有較高的準(zhǔn)確性。

圖8 各因素交互作用對(duì)百香果籽油提油率的影響

2.5 DPPH自由基清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖9 油脂的DPPH自由基清除率

百香果籽油對(duì)DPPH自由基清除率結(jié)果見(jiàn)圖9，百香果籽油在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，清除能力隨著油脂濃度的增加而增強(qiáng)，最大清除率可達(dá)到78.6%。與橄欖油及山核桃油這兩種優(yōu)質(zhì)食用油相比，結(jié)果表明清除能力相近，體外抗氧化活性較強(qiáng)。整體可以看出水酶法提取的百香果籽油的DPPH自由基清除率效果較好。

2.6 理化指標(biāo)測(cè)定

對(duì)所選品種的百香果籽進(jìn)行油脂含量實(shí)驗(yàn)，其粗脂肪含量為20%。通過(guò)最佳工藝條件，所提取的油脂呈淡黃色，透明度好，無(wú)異味略帶百香果芳香味。百香果籽油酸價(jià)不大于4.0mg KOH/g，過(guò)氧化值不大于0.25g/100g，由表6可知，水酶法提取的百香果籽油均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)水酶法所提取的百香果籽油在270nm～350nm范圍內(nèi)紫外吸收較強(qiáng)，表明其有一定的防護(hù)作用，百香果香氣成分豐富，其油也有一定的香味，可用于化妝品中的防曬產(chǎn)品與香水產(chǎn)品。

表6 百香果籽油理化指標(biāo)結(jié)果

3 結(jié)論

為了提高百香果籽油的提油率，對(duì)單一酶及復(fù)合酶的種類進(jìn)行了篩選，確定了木瓜蛋白酶、糖化酶及葡聚糖酶為研究對(duì)象的提取工藝。經(jīng)混料實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，確定木瓜蛋白酶、葡聚糖酶與糖化酶的最佳配比為8∶1∶1。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得出，酶解溫度為50℃～60℃、酶制劑用量為3%～5%、pH值為5～6，作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)范圍。通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定提取百香果籽油的最佳工藝為：酶解溫度為50℃、酶制劑用量為4.96%、pH值為6、時(shí)間6h、料液比1∶3。在此條件下提油率可達(dá)58.75%，提取的百香果籽油色澤良好、透明度好、氣味芬芳無(wú)異味。對(duì)百香果籽油的紫外測(cè)定發(fā)現(xiàn)其在270nm～350nm紫外吸收較強(qiáng)，水酶法方式提取的百香果籽油DPPH清除能力較好。