焦淑靜，王紅坡

（1.商丘市第三人民醫(yī)院檢驗科，河南 商丘476000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院磁共振科，河南 衛(wèi)輝 453100）

結(jié)核性胸膜炎屬于結(jié)核分枝桿菌感染累及胸膜的一種炎癥疾病，發(fā)熱、胸痛、乏力、呼吸困難等是此病的常見臨床癥狀[1]。結(jié)核性胸腔積液中的纖維蛋白容易沉著在人體胸膜表面,產(chǎn)生積液包裹以及形成胸膜肥厚,進而發(fā)生限制性通氣障礙[2]。為此,在治療結(jié)核性胸膜炎疾病過程中應(yīng)注重胸膜炎性反應(yīng)的抑制、抑制胸膜增厚。miRNAs屬于近年來新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼小RNA,研究證實[3,4]其表達失調(diào)與腫瘤疾病、炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。目前,有關(guān)hsa-miR-144在結(jié)核性胸膜肥厚患者中的研究報道尚少。結(jié)核病和免疫緊密相關(guān)，研究證實[5]Thl細胞分泌出來的γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素 6(IL-6)等細胞因子參與了結(jié)核病患者的免疫病理過程。因此我們采用RT-PCR法檢測結(jié)核性胸膜肥厚患者外周血中hsa-miR-144的表達并分析其與血漿中炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6 的相關(guān)性,以進一步探討其在結(jié)核性胸膜肥厚發(fā)病中的作用,為臨床診治此病提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月-2018年3月河南省商丘市第三人民醫(yī)院80例臨床診斷結(jié)核性胸膜肥厚患者的外周血標本，其中男50例，女30例，年齡 21～65 歲，平均(41.3±2.4)歲；臨床表現(xiàn)：咳嗽、咳痰45例，胸疼25例，發(fā)熱伴胸疼10例；胸腔積液量 940～2830 ml，平均(2316.7±54.8)ml；發(fā)病至入院就診時間 1～10 d，平均(5.1±1.6)d；單純性結(jié)核性胸膜炎60例，肺結(jié)核合并結(jié)核性胸膜炎20例。入選標準：均經(jīng)胸膜活檢病理確診或痰涂片抗酸染色陽性者；經(jīng)胸部螺旋CT檢查顯示胸膜肥厚者[6]。排除標準：存在活動性肺內(nèi)病變者；心、肝、腎及肺功能異常者；有神經(jīng)系統(tǒng)疾病及代謝性疾病者；存在免疫缺陷病者;孕婦或哺乳期婦女；藥物過敏者;對胸腔穿刺引流術(shù)不可耐受者。另收集80例健康對照者的外周血標本，其中男48例，女32例；年齡 22～64 歲，平均(40.8±2.1)歲。

1.2 儀器和試劑 Ficoll淋巴細胞分離液購自北京中西遠大科技有限公司；Trizol試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司；Taqman miRNAs反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser均購自上海捷瑞生物工程有限公司；SYBRRPremix Ex TaqTM購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。 IFN-γ、TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒均購自北京百奧萊博科技有限公司。實時熒光定量PCR儀購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標本收集及處理 空腹采集研究對象的靜脈血5ml于肝素鈉抗凝管中，混勻備用。運用常規(guī)方法使用Ficoll淋巴細胞分離液提取PBMC。

1.3.2 hsa-miR-144的檢測 依據(jù)Trizol試劑說明書提取研究對象的PBMC總RNA，測定總RNA濃度及質(zhì)量。運用SYBR法實施RT-PCR檢測，引物由北京密碼子生物科技有限公司設(shè)計及合成。采用Taqman miRNAs反轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNAs特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem-loop）反轉(zhuǎn)錄引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄條件：16℃孵育 2 min，42℃反應(yīng) 1 min，50℃反應(yīng) 1 s，40個循環(huán)，再 85℃孵育 5 min，4℃終止反應(yīng)。預(yù)擴增反應(yīng)條件：95℃ 10 min，55℃、72℃分別反應(yīng) 2 min，95℃ 15 s，60 ℃40 min，12個循環(huán)，99.9℃孵育10 min。漩渦混勻TaqMan?通用PCR預(yù)混PCR反應(yīng)液。hsa-miR-144熒光定量PCR引物。PCR反應(yīng)條件：94.5℃反應(yīng) 10 min，97 ℃ 30 s，59.7 ℃ 1 min，40 個循環(huán)反應(yīng)。內(nèi)參U6引物序列 ：上游引物5'-GCGCGTCG TGAAGCGTTC-3'，下游引物 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。hsa-miR-144引物序列：上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTCCCAGGA-3',下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT TCAGTTGAGAGGGATTC-3'。以2-△△Ct表示結(jié)核性胸膜肥厚患者PBMC中目的基因的表達相對和健康對照者的變化倍數(shù)。

1.3.3 血漿炎性因子的檢測 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定研究對象血漿炎性因子γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素 6(IL-6)表達水平。具體步驟依據(jù)IFN-γ、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒的說明書操作。正常值范圍：IFN-γ 為 0～20 ng/L,TNF-α 為 0～60 ng/L，IL-6 為0～40ng/L。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。符合正態(tài)分布定量資料的統(tǒng)計描述,采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗，hsa-miR-144與血漿炎性因子的相互關(guān)系采用spearman檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核性胸膜肥厚患者與健康對照者PBMC中hsa-miR-144表達水平比較 通過RT-PCR法測定80例結(jié)核性胸膜肥厚患者與80例健康對照者PBMC中hsa-miR-144的表達差異。結(jié)核性胸膜肥厚組PBMC中的hsa-miR-14 4水平明顯高于健康對照組（P＜0.01），見圖 1。

2.2 結(jié)核性胸膜肥厚患者與健康對照者血漿炎性因子水平比較 ELISA法檢測結(jié)果顯示，結(jié)核性胸膜肥厚組血漿炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6分別為（47.16±4.08）ng/L、（72.83±3.22）ng/L、（61.97±5.1 1）ng/L，均明顯高于健康對照組（P＜0.05），見表 1。

圖1 RT-PCR法檢測PBMC中hsa-miR-144的相對表達量

表1 ELISA法檢測血漿炎性因子水平比較

2.3 相關(guān)性分析 spearman相關(guān)性分析顯示，結(jié)核性胸膜肥厚患者外周血PBMC中hsa-miR-144與血漿炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6水平存在相關(guān)性 （r=0.384，P＜0.05；r=0.396，P＜0.05；r=0.361，P＜0.05），見表 2。

表2 hsa-miR-144與血漿炎性因子相關(guān)分析（n=80）

3 討論

結(jié)核性胸膜肥厚屬于臨床常見的呼吸內(nèi)科疾病，其發(fā)病機制尚不清楚[7,8]。相關(guān)資料顯示[9]，miR NA廣泛參與細胞侵襲、細胞凋亡等多種過程，也參與免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。近年，hsa-miR-144在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控作用逐漸受到人們的關(guān)注及重視。如譚燕[10]采用實時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測顯示，hsa-miR-144在肺結(jié)核病人血液中的表達明顯高于健康人員，且患者經(jīng)治療后hsa-miR-144表達水平顯著下降。本文結(jié)果顯示，結(jié)核性胸膜肥厚組PBMC中的hsa-miR-144水平明顯高于健康對照組（P＜0.01）。提示hsa-miR-144與結(jié)核性胸膜肥厚發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過檢測外周血hsa-miR-144表達水平可用于結(jié)核性胸膜肥厚臨床診斷與療效評價。

作為一個重要的免疫調(diào)節(jié)因子，IFN-γ在結(jié)核感染中一方面可以促進Th1與巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，另一方面可以抑制Th2與嗜酸粒細胞的炎癥反應(yīng)進而強化細胞的免疫應(yīng)答作用[11]。TNF-α可以參與抗感染、發(fā)熱等多種病理生理過程，在結(jié)核感染中可以激發(fā)局部免疫細胞釋放許多趨化因子，誘導(dǎo)外周血單核細胞不斷遷移到病變部位以誘發(fā)遲發(fā)型的變態(tài)反應(yīng)[12,13]。有研究顯示[14-16],IL-6與肺結(jié)核病變活動關(guān)系相關(guān)。本文結(jié)果顯示，結(jié)核性胸膜肥厚組血漿炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6均明顯高于健康對照組（P＜0.05）。提示結(jié)核性胸膜肥厚患者血漿中炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6存在異常表達。并發(fā)現(xiàn)hsa-miR-144的表達與IFN-γ、TNF-α、IL-6呈明顯正相關(guān),提示hsa-miR-144可能是通過促進致炎因子的表達，促進結(jié)核性胸膜肥厚的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，檢測體內(nèi)hsa-miR-144及IFN-γ、TNF-α、IL-6細胞因子水平可以深入了解結(jié)核性胸膜肥厚的發(fā)病機制，有助于判斷疾病進程，評價患者的預(yù)后。此外，通過分析hsa-miR-144及IFN-γ、TNF-α、IL-6在外周血中分泌水平差別，有可能成為結(jié)核性胸膜肥厚臨床診斷的依據(jù)。