劉曉慶,李健雄，劉師文，肖芳，施勇，熊英

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029)

消滅脊髓灰質(zhì)炎的最終目的是阻斷脊髓灰質(zhì)炎野病毒的傳播,目前這一工作已取得了重大進(jìn)展,并且Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒已從自然界消失[1]，事實(shí)上導(dǎo)致15歲以下的兒童出現(xiàn)麻痹的，除了脊髓灰質(zhì)炎病毒外，還有許多非脊灰腸道病毒。近些年來，隨著脊灰病毒的消滅，由非脊灰腸道病毒引起的急性弛緩性麻痹越來越吸引人們的眼球。為了解NPEV的分布特征和流行病學(xué)規(guī)律,迫切需要對NPEV中的腸道病毒進(jìn)行型別鑒定。近年來，國際上建立了應(yīng)用分子生物學(xué)方法對腸道病毒進(jìn)行分型鑒定的方法,為探索江西省急性弛緩性麻痹病例中的NPEV的感染情況,本研究對2013年-2017年從急性弛緩性麻痹(AFP)病例中分離到的NPEV進(jìn)行分子定型，探討其型別分布情況以及流行病學(xué)規(guī)律。

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)資料來源 AFP病例資料來源于AFP病例監(jiān)測信息管理系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫、江西省疾病預(yù)防控制中心脊灰實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測數(shù)據(jù)。

1.2 糞便標(biāo)本處理 來源于2013年-2017年江西省AFP病例監(jiān)測系統(tǒng)報(bào)告的AFP病例(15歲以下兒童),絕大部分病例按照WHO的要求采集雙份糞便，所有糞便標(biāo)本按照WHO《脊髓灰質(zhì)炎病毒實(shí)驗(yàn)室操作手冊》處理后接種于WHO推薦的RD和L20B細(xì)胞[2]，出現(xiàn)病變后，采用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）方法進(jìn)行脊灰病毒型別鑒定。本文對歷年來本實(shí)驗(yàn)室保存的存的脊髓灰質(zhì)炎病毒株進(jìn)行病毒型別鑒定。

2 方法

2.1 病毒核酸的提取及引物設(shè)計(jì) 取病毒培養(yǎng)液200μl，按 QIAamp Viral RNA Mini kit（試劑生產(chǎn)批號：130188374）試劑5滴說明書操作。RT-PCR及測序引物參照文獻(xiàn)[3-5]按Oberste的方法選用不同的引物對（187/222，188/222，189/222）進(jìn)行 VP1 區(qū)基因序列擴(kuò)增，對用上述引物不能擴(kuò)增的毒株，選用其他引物對擴(kuò)增（187/011，040/011）擴(kuò)增[6]，引物序列：

187：5′-ACIGCIGYIGARACIGGNNCA-3′；

188：5′-ACIGCIGTIGARACIGGNG-3′；

189：5′CARGCIGCIGARACIGGNGC-3′；

222：5′-CICCIGGIGGIAYRWACAT-3′；

011：5′-GCICCIGAYTGITGICCRAA-3′

187：5′-ACIGCIGYIGARACIGGNCA-3′

040：5′-ATGTAYRTICCIMCIGGZGC-3′

2.2 RT-PCR與序列測定 RT-PCR反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[3]，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳（1.5%凝膠，0.5ug/ml溴化乙錠）檢測，陽性產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序。

2.3 結(jié)果分析 應(yīng)用 Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。

3 結(jié)果

3.1 NPEV分離率 2013年-2017年江西省共報(bào)告AFP病例522例,分離獲得136株NPEV,AFP病例中NPEV的分離率各年有所不同,平均分離率為7.28%，詳見表 1、表 2。

3.2 時(shí)間分布 2013-2017年每個(gè)月均可分離到腸道病毒，NPEV有明顯的夏秋季高峰,分離率在5-8月均較高,5-8月份腸道病毒感染病例占49.81%，其中8月最高。見圖1。

表1 江西省2013年～2017年AFP及其接觸者NPEV分離情況

表2 不同年齡組AFP病例的非脊灰腸道病毒感染率

圖1

3.3 地區(qū)分布 腸道病毒感染AFP病例分布于11個(gè)市,吉安市AFP病例腸道病毒感染率最高，為12.42%，其次為萍鄉(xiāng)市 (12.24%)、新余市(11.39%)，景德鎮(zhèn)市未分離得到腸道病毒，九江市和南昌市較低，為1.3%和1.6%。

3.4 人群分布 腸道病毒感染病例年齡2月齡～13歲,主要為5歲以下兒童，占80.15%(109/136)。男性病例感染率為63.97% (87例),女性為36.03%(49 例),見表 2。

3.5 測序定型結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，陽性產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序,陽性電泳圖譜見圖2。

對136株NPEV進(jìn)行測序分型，132株有序列結(jié)果,分別屬于A組腸道病毒(HEV-A)，HEV-B和HEV-C，無HEV-D病毒株，HEV-A包括7個(gè)基因型49株(37.12%,49/132),HEV-B組毒株包括14個(gè)基因型82株(62.12%,82/132)，HEV-C組毒株包括1個(gè)基因型1株(0.76%,1/132)。 見表3、表4、表5。

圖2 部分非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒PCR產(chǎn)物電泳圖譜

表3 2013-2015年江西省NPEV基因分型分組鑒定結(jié)果

表4 2013-2015年江西省基因分型鑒定基因A組結(jié)果

表5 2013-2015年江西省基因分型鑒定基因B組結(jié)果

4 討論

脊灰是嚴(yán)重危害兒童健康的急性傳染病，曾經(jīng)是致殘的主要疾病之一[7]。消滅脊灰的工作目前已經(jīng)取得重大進(jìn)展，江西省2013年-2017年急性弛緩性麻痹病例中未監(jiān)測到野病毒,證實(shí)江西已經(jīng)消滅了脊灰野病毒，并實(shí)現(xiàn)了從1992年至今連續(xù)25年無脊灰野病毒病例發(fā)生的目標(biāo)[8]。從而加強(qiáng)對AFP病例標(biāo)本中非脊灰腸道病毒的監(jiān)測,有助于進(jìn)一步了解我省腸道病毒的循環(huán)特點(diǎn)。

本次監(jiān)測結(jié)果顯示,江西省2013年-2014年AFP病例糞便標(biāo)本中的非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒的平均分離率為7.28%,其中最高為12.87%（2014年），最低為2.80%（2015年）；其感染有明顯的夏秋季節(jié)，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類似[9,10]?？赡芟那锛緶嘏瘽駶櫟臍夂蛴兄诓《镜纳婕胺敝?；各地區(qū)的NPEV感染情況不同,其中景德鎮(zhèn)市未分離到非脊灰腸道病毒；各年齡組的感染率也不同，主要分布在5歲以下小年齡組兒童中,男性比例高于女性，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。

腸道病毒種類眾多，血清型可分為A、B、C和D共4個(gè)組。一種型別的腸道病毒往往可引起幾種疾病或病征,而一種疾病或病征也可因幾種型別引起。因此，對病原體進(jìn)行分型鑒定，后續(xù)可以進(jìn)一步了解病毒型別與臨床癥狀之間的關(guān)系，確定在一次疾病的暴發(fā)或流行中各病例間的流行病學(xué)關(guān)系,長期監(jiān)測數(shù)據(jù)的積累可判斷腸道病毒血清型的流行趨勢。免疫接種過程中,部分小孩接種OPV后,會(huì)出現(xiàn)肢體麻痹等不良反應(yīng),其發(fā)生機(jī)制可能是由于疫苗株病毒的突變或返祖后對神經(jīng)組織更具親嗜性,但從AFP病例中分離出的不同型別的非脊灰腸道病毒，是否是引起AFP病例麻痹的原因，其致病機(jī)制以及不同型別的非脊灰腸道病毒引起的臨床特征,將有待于進(jìn)一步深化研究?；谌蛳麥缂够业倪M(jìn)展，AFP病例的監(jiān)測將重點(diǎn)關(guān)注NPEV的病原譜研究，病原譜的研究將為NPEV引起的疾病的診斷提供依據(jù),為可能發(fā)生的暴發(fā)流行提供預(yù)測預(yù)警[12]。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外陸續(xù)建立了一些用于腸道病毒分型鑒定的方法，并使用此法鑒定了許多新型EV。這些方法基于RT-PCR，然后進(jìn)行核苷酸序列分析或分子雜交。

本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)了5對引物,對江西省省2013-2017年從急性弛緩性麻痹病例中分離到的136株非脊灰腸道病毒進(jìn)行了VP1區(qū)基因擴(kuò)增和序列分析。結(jié)果顯示，以A組和B組的為主，與云南省報(bào)道的結(jié)果一致[13]。其中A組的EV71型別所占比例最高，表明近幾年來江西省有EV71病毒的流行,但是否為江西省近5年非脊灰腸道病毒流行的優(yōu)勢毒株,還需要結(jié)合這幾年的有關(guān)資料進(jìn)一步分析判斷。

本次檢測中分離到的EV71型病毒,是能導(dǎo)致無菌性腦膜炎和手足口病的典型病毒,并可能引起暴發(fā)[14]。另外還分離到1株新型腸道病毒EV96，對新型腸道病毒詳細(xì)的臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特征有待進(jìn)一步研究。江西省本次分離到的NPEV中，HEV-A和HEV-B和HEV-C組病毒都有，沒有發(fā)現(xiàn)D組病毒，并以HEV-B組最多,而A組的EV71是主要流行病毒。

通過對江西省2013-2017年AFP病例糞便中NPEV的研究,初步探討了AFP病例的NPEV病毒分布特點(diǎn),也為今后江西省建立基于實(shí)驗(yàn)室的病原學(xué)監(jiān)測奠定基礎(chǔ)。