尹冶，段秋婷，周晉宇，陳振杰，輝紅蕾綜述；王玉明審校

（昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院1.檢驗科；2.泌尿外科，云南 昆明 650000）

截止2019年,美國確診的PCa病例數(shù)超過174,650例，約31,620人死于該病[1]。我國男性PCa發(fā)病率與死亡率均呈快速上升的趨勢,據(jù)國家癌癥登記中心統(tǒng)計，截止2015年，該病患病人數(shù)超過6萬，死亡率達1/3，而這些數(shù)據(jù)僅僅覆蓋了全國人口的6.5%[2]，情況不容樂觀。該病早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時常已是晚期,雄激素剝奪療法(Androgen deprivation therapy,ADT)是晚期PCa的主要治療方案，然而，絕大多數(shù)患者在經過一定的緩解期后開始抵抗內分泌治療,最終發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC),并常伴器官轉移，預后較差，死亡率高[3]。前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）是臨床公認的PCa標記物，有較高的組織特異性，但PSA的水平受前列腺癌分化程度和轉移情況的影響，且在良性和惡性前列腺疾病中均升高，一定數(shù)值范圍內不具腫瘤特異性[4]。研究表明[5-8]，雄激素受體（androgen receptor，AR）信號通路再激活是CRPC發(fā)生、發(fā)展和耐藥的重要作用機制，AR-V7在CRPC患者中高表達并與PSA濃度正相關，是激活這一通路的關鍵所在，也是CRPC最具潛力的標記物。但目前AR-V7的檢測技術要求嚴格且難以推廣,臨床研究中一直缺乏大量的前瞻性數(shù)據(jù)對ARV7作為CRPC的新標記物進行可靠的驗證。可喜的是，近年來AR-V7的檢測手段取得了一系列的新突破，為推進AR-V7在臨床常規(guī)中的應用提供重要的技術支持。

1 AR-V7的結構

AR是核受體超家族中的一種類固醇類反轉錄調節(jié)蛋白,其基因位于Xq11-12，有八個外顯子和七個內含子，可編碼919個氨基酸。全長型雄激素受體（full-length androgen receptor,AR-FL）包括氨基末端域 (N-terminal domain,NTD)、DNA結合域（DNA-binding domain,DBD）、鉸鏈區(qū)和羧基末端配體結合域 (ligand-binding domain,LBD)見圖1。AR基因剪切重組后mRNA的翻譯停止在第16位氨基酸，形成缺乏LBD域的截短型AR受體，稱為雄激素受體剪切變異體（androgen receptor splice variants,AR-Vs），AR-V7 在 20 多種 AR-Vs中含量最多最具代表性,可檢測其同源編碼蛋白[9]。ARV7具有完整的NTD域、DBD域以及一個特殊的C端。NTD結合轉錄共調節(jié)因子后形成AF-1，并通過配體非依賴途徑活化,在無雄激素結合時仍然激活靶基因的轉錄；DBD內含兩個α螺旋型鋅指結構，參與特異堿基序列的識別，并促進雄激素反應元件同AR的結合；C端延伸結構域的作用目前研究較少。

圖1 全長雄激素受體（AR-FL）和剪切變異體7（AR-V7）轉錄物結構

2 AR-V7檢測方法的新進展

對于CRPC中AR-V7的檢測，富集循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）提取 RNA 進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）是目前最常用的方法。迄今為止，美國臨床上有兩種常用的基于CTC的檢測試劑[10]：Qiagen公司2018年在美國癌癥協(xié)會年會上推出的Adna Test Prostate Cancer Panel AR-V7 Kit試劑盒,用PCR檢測被捕獲的CTC中AR-V7的水平；另一種是最近推出的將免疫熒光應用于CTC中AR-V7蛋白質的分析。常規(guī)活檢組織的檢測則以RNA原位雜交（RISH）、熒光原位雜交（FISH）、免疫組織化學染色（IHC）、轉錄組測序技術（RNA-Seq）和蛋白印跡等為主。近年來，全血和尿液標本中的AR-V7檢測引起了研究人員的注意，大量研究開始著力于完善和優(yōu)化常規(guī)檢測手段并開發(fā)無創(chuàng)、簡便和高效的技術。

2.1 活檢組織中AR-V7的檢測 目前,前列腺穿刺活檢仍然是診斷PCa的金標準,新鮮活檢組織常直接冷凍或用福爾馬林固定后制成石蠟包埋切片（FFPE）。常規(guī)AR-V7原位檢測以AR基因內含子3內的隱蔽外顯3b（CE3b）為靶位，使用集成的探針設計和信號放大策略將目標信號放大數(shù)千倍，雖然與傳統(tǒng)的原位檢測相比，信噪比得以降低，但需要多個平鋪探針覆蓋1kb以上的靶序列，且AR-FL同樣具有CE3b序列，故AR-V7特異性剪切點的檢測分辨率較低。對此，Yezi等[11]設計并優(yōu)化了一種稱為BaseScope的探針，開發(fā)出高度特異和可量化的新型RISH方法，該探針分別跨越AR外顯子 3（E3）和 CE3b、外顯子 7（E7）和外顯子 8（E8），連接形成“雙 Z”型的寡核苷酸序列（1-ZZ）并靶向覆蓋單個剪切點,不同跨越點的剪切點可分別對AR-V7和AR-FL特異。應用這種新方法定量檢測44名轉移性CRPC患者活檢組織中的AR-V7，若以0.4為RISH結果的cut-off值，則15名患者AR-V7陽性，且經LNCaP95細胞驗證發(fā)現(xiàn)BaseScope探針的特異性優(yōu)于常規(guī)探針。

原位檢測與蛋白印跡、RNA-Seq等方法聯(lián)合可提高AR-V7檢測的特異性和靈敏度[12,13]。Djusberg等[14]通過分析FISH的PCR拷貝數(shù)來評估AR基因的擴增，用微陣列檢測CRPC患者AR基因擴增時AR-V7mRNA的表達水平,并對高表達的標本進行IHC,最后用共聚焦顯微鏡進行蛋白定位的驗證，結果顯示核定位染色增加,證實了AR-V7存在于細胞核中。LiHeng等[15]用兔單克隆抗體對168例CRPC活檢組織進行IHC,根據(jù)免疫反應評分（A R-V7陽性：>2）分析AR-V7的表達情況。該研究考慮到PCa的異質性，選擇AR-V7表達最強的區(qū)域進行評估,并用靶向E1、E7和CE3b的siRNA轉染LNCaP和22Rv1細胞作為陰性對照，以確保單克隆抗體與AR-V7的特異性結合。32例AR-V7陽性切片顯示，AR-V7主要分散表達于惡性PCa的腔上皮細胞核中,且該類細胞占惡性腺體的15%-80%。另外，血管和基質細胞AR-V7為陰性，可考慮作為IHC的內部對照。兔單克隆抗體雖被普遍使用，但抗體常結合組織中的其他蛋白質，降低檢測的特異性。因此，Sharp等[16]針對CE3b開發(fā)出重組兔單克隆抗體（RM7）,用western印跡驗證抗體分子量，并通過免疫沉淀證實RM7與原有的ARV7抗體EPR15656相比，特異性和親和力均增加，脫靶率降低。以RM7為優(yōu)化抗體進行CRPC組織的IHC檢測，133份FFPE標本中有34份AR-V7核染色陽性（核H評分＞10），其中41份轉移性腫瘤標本的RNA-Seq轉錄分析表明407個基因與AR-V7高表達相關。

組織活檢標本中AR-V7的檢測經濟簡便、結果直觀、靈敏度較高，但檢測周期冗長、抗體特異性不足、難以長期保存。不可否認的是，即使量化標準不同，原位檢測仍是活檢組織檢查的關鍵技術，開發(fā)更高效可行的檢測手段將推進AR-V7在臨床中的實際應用。

2.2 CTC中AR-V7的檢測 相比侵入性組織活檢,液體活檢近幾年有巨大的發(fā)展趨勢。FDA將CTC定義為有核（DAPI+）、白細胞抗原陰性（CD45-）的上皮細胞（CK+），并批準CTC計數(shù)作為PCa的預后評價指標[17]。但人體外周血中CTC僅占白細胞的百萬分之一，細胞富集是檢測的關鍵。識別上皮源性標志物（如上皮細胞粘附分子和細胞角蛋白）的免疫細胞磁性富集法，借助鐵磁流體、磁性微粒或納米粒子等膠體分散體，加以磁場進行強磁化，鐵磁流體中的磁性顆粒涂覆有針對上皮源性標志物的抗體。一旦系統(tǒng)捕獲靶細胞，便用對上皮細胞特異的熒光抗體進行標記,從而對CTC進行計數(shù)等系列分析[18]。也有其他平臺根據(jù)形態(tài)差異和電生理特征來捕獲CTC。但在完成上皮-間充質轉化過程中CTC的上皮細胞粘附分子減少或形態(tài)特征發(fā)生變化時，識別便無法進行。且以CTC計數(shù)≥5的標準來評估PCa患者的生存預后可信度低,臨床獲益小，而CTC中AR-V7的檢測可提供計數(shù)外的諸多信息,關鍵在于如何在數(shù)十億個血細胞中有效富集CTC以裂解進行qRT-PCR，且目前有關AR-V7轉錄物比例的定量信息較少。

半自動化CellSearch?系統(tǒng)是經過全面的臨床試驗后唯一獲得FDA批準用于CTC計數(shù)的金標準，該系統(tǒng)的出現(xiàn)使CTC中AR-V7的相關研究得以深入開展[19,20]。Sharp等[21]用AdnaTest試劑盒測定181名CRPC患者CTC(由CellSearch計數(shù))中的AR-V7，35%患者CTC+/AR-V7+,但尚無證據(jù)表明CTC中AR-V7陰性患者的生存率比陽性患者低,且無CTC計數(shù)的患者取癌組織經IHC亦可檢測到AR-V7,這提示了有關CTC中AR-V7狀態(tài)的預后研究必須考慮CTC計數(shù)以增加敏感度。應該提及的是,研究證明[22]qRT-PCR中SYBRGreenⅠ法和TaqMan探針法對CTC中AR-V7檢測分析的性能具有高度的一致性，二者均可用于AR-V7的檢測。目前，El-Heliebi等[23]新提出基于細胞水平的原位鎖定探針技術較有優(yōu)勢,通過將體內可用的CTC富集裝置（CellCollector）與細胞鎖定技術相結合檢測AR-V7mRNA，并用CellSearch進行免疫染色，分析AR-V7在核中的特異性定位。同時將原位檢測與英國NAGLE公司的parsortix系統(tǒng)相結合，根據(jù)CTC的大小和多形性進行分類收集，觀察細胞角蛋白的狀態(tài)，從而對CTC的異質性（從上皮細胞到間充質細胞各階段的分化）進行評估。該技術無需裂解CTC，以熒光信號來可視化和定量分析AR-V7的表達水平，同時定量CTC并觀察其異質性，是AR-V7檢測技術的重要突破。

富集CTC檢測AR-V7相比其他手段高效快速、特異性高，但技術要求嚴格，且無CTC計數(shù)者無法對AR-V7的狀態(tài)和定量進行確定。意大利的分子診斷與藥物遺傳研究部制定了一組標準化操作程序（SOP），從實驗室和臨床的角度對AR-V7的檢測進行了標準化的評估驗證[24]。該SOP對CT C富集和AR-V7檢測的標準化規(guī)范解決了批間變異、測定誤差、試劑運輸（干冰運輸）和儲存影響（-80℃）等問題,以凍干法保存樣品可極大地改善CT C中AR-V7的穩(wěn)定性,減少實驗室之間的質量控制差異。此外，該SOP對結果的報告形式也提出建議：陽性（>10拷貝/ml富集全血）或陰性（<10拷貝/ml富集全血）；AR-V7/AR-FL值僅適用于陽性樣品。

2.3 全血中AR-V7的檢測 研究認為全血中的A R-V7mRNA比CTC中更易檢測,且在不同實驗室之間有更高的再現(xiàn)性,甚至長期儲存的全血樣本也可檢測[25]。液滴數(shù)字聚合酶鏈式反應 (droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)是第三代 PC R技術（dPCR）與液滴微流控技術的結合，近年來廣泛應用于PCa的相關研究中。樣本溶液在微流控芯片中被高效精確地分成102~107個小液滴[26]，每個液滴包含至多一個目的基因,并作為獨立反應單元各自進行的PCR擴增,以含有目標基因的液滴發(fā)出熒光為陽性,根據(jù)陽性液滴比例和泊松分布對目的基因進行精密的絕對定量。有研究[27]在21間國際實驗室內部對dPCR檢測可變異序列的可重復性進行驗證，確定了dPCR在各實驗室間具有高度的可重復性，這說明AR-V7分子診斷的應用具備指導臨床治療的潛力。Seitz等[28]應用高敏感的ddPCR對長期儲存在生物樣本庫內的85份CRPC全血樣本進行AR-V7mRNA檢測，15例AR-V7呈高水平，且經多變量邏輯回歸分析，AR-V7是PSA應答的獨立預測因子。另外，Xichun等[29]用RT-PCR直接檢測保存在PAXgene?管中的46份CRPC全血AR-V7，陽性率達67.53%。上述研究雖未考慮健康獻血者，但研究已表明[25]在健康獻血者外周血的4000個單個核細胞中并未檢測到ARV7。Fangfang等[30]離心132例CRPC患者的全血并分離出單個核細胞，以ddPCR評估AR-V7在其中的表達水平,結果顯示95%的患者AR-V7轉錄物均超過19拷貝/μgRNA。此外，研究者通過ddPCR在CRPC患者的血漿中也檢測到AR-V7,源自癌細胞釋放于血液中具有脂質雙分子層的納米級細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，稱為血漿外泌體[31]。盡管全血標本方便獲取，但有研究[32]比較了乙二胺四乙酸（EDTA）采血管、檸檬酸鹽采血管和含有防腐劑的采血管的有效性,最終只在前兩種采血管室溫儲存48h后仍可檢測到AR-V7，該結果為全血中AR-V7的檢測做了細節(jié)性提示。

全血中AR-V7的檢測來源簡單、經濟安全且具有很好的臨床應用前景，然而，部分研究表明[33]AR-V7也可能存在于非惡性細胞 （如癌旁組織或良性腺體）中，但多數(shù)相關研究卻未對全血樣本的檢測進行廣泛地驗證。因此，該檢測手段在推廣應用于臨床診療之前仍需進一步的驗證。

2.4 尿液中AR-V7的檢測 研究者[34]用放射電子顯微鏡觀察到PCa患者尿液中存在的EVs,并通過正丁醇提取到異常增加的尿囊泡相關性PSA，顯示了EVs對PCa患者潛在的診斷價值。尿液EVs可濃縮分子并保護其免受高RNA酶環(huán)境的影響，能提供關于整個泌尿系統(tǒng)甚至全身狀態(tài)的信息，甲基化DNA、miRNA、大量蛋白質和腫瘤相關代謝產物等均被證明在尿囊泡中具有可測水平[35,36]。不同分離方法對尿EVs顯示出不同的親和力,但數(shù)據(jù)表明[37]應用尿外泌體RNA分離試劑盒（NORGEN）進行分離純化的EVs，其目的基因檢出率較高，尿液中的EVs也被證明存在可測的AR-V7。有研究[38]在14名CRPC患者的尿液EVs中檢測到高水平的AR-V7和低表達的AR-FL,而22名激素敏感型PCa患者的AR-V7呈低表達。該研究采用非侵入性尿液檢測的方法,用基于酶聯(lián)免疫吸附的納濾單元組成的微流體裝置分離EVs并快速富集，通過ddPCR定量AR-V7和AR-FL的絕對濃度 （每毫升拷貝數(shù)）。該研究首次報道了尿液中的EVs是分析AR-V7表達的可靠來源，這一無創(chuàng)性的方法或將開啟AR-V7檢測的新思路。但AR-V7的檢測將影響臨床決策,且以尿液為標本檢測AR-V7的研究還較少,后續(xù)仍需要大量的驗證研究以提供更多可靠的數(shù)據(jù)。

3 小結與展望

AR-V7是目前CRPC最具潛力的新生標記物，但在正式應用于臨床前，我們仍需進行大規(guī)模的前瞻性研究對其進行驗證。AR-V7的檢測手段利弊各異，尚未有數(shù)據(jù)對其進行比較和統(tǒng)一，目前的檢測水平已經打破組織活檢的單一格局，在AR-V7的檢測來源和檢測技術上都取得了新的突破。靈敏度和特異性更高的檢測手段能精確定量AR-V7的水平,使其更好地應用在晚期PCa患者的診療優(yōu)化和預后評估中。然而，我們依舊面臨諸多挑戰(zhàn)，如何解決PCa異質性對AR-V7特異性檢測的影響？檢測血液和尿液來源的AR-V7是否更高效合理？如何將檢測技術簡單化并得到最終標準以利于推廣應用？相信隨著分子診斷、基因測序和生物信息等技術的進步，在科研人員、臨床醫(yī)生和實驗室專家的深入研究后，AR-V7的精確檢測將廣泛應用于臨床并為CRPC患者提供更多益處。