呂麗麗 張琳琳 曹宇峰 王磊 邊月平

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【摘要】 目的觀察健脾補(bǔ)腎方對(duì)再生障礙性貧血(AA)大鼠骨髓造血功能的影響，并從自噬角度探討其治療機(jī)制。方法40只SPF級(jí) Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組，每組10只。除空白組外，其余3組采用腹腔注射氟尿嘧啶和灌胃馬利蘭溶解液的方法制作AA大鼠模型。造模成功后，健脾補(bǔ)腎方組灌胃給予健脾補(bǔ)腎方，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予司坦唑醇混懸液，空白組和模型組灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)給藥2周。計(jì)數(shù)2組外周血細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞數(shù)，并檢測(cè)2組外周血T淋巴細(xì)胞亞群、血清細(xì)胞因子、骨髓細(xì)胞周期、增殖指數(shù)(PI)及自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組外周血Hb、Ret、WBC、PLT、CD3+、CD4+、Treg細(xì)胞比例、CD4+/CD8+、血清IL-11水平、骨髓紅系比例、粒系比例、巨核細(xì)胞數(shù)、骨髓細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞比例、PI及LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯高于模型組，外周血CD8+細(xì)胞比例、血清IL-2、TNF-α水平、骨髓淋巴細(xì)胞比例、骨髓細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例及caspase-3、PARP蛋白表達(dá)均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論健脾補(bǔ)腎方能夠促進(jìn)AA大鼠骨髓造血功能恢復(fù)，改善外周血象，并增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，其機(jī)制可能與促進(jìn)骨髓細(xì)胞自噬有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】健脾補(bǔ)腎方；再生障礙性貧血；造血功能

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 556.5【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1002-7386(2020)05-0714-04

EffectsofJianshenbupiprescriptiononhematopoieticfunctioninratswithaplasticanemiaandrelatedactionmechanisms

LVLili,ZHANGLinlin,CAOYufeng,etal.DepartmentofHematology,TheFirstHospitalofZhangjiakouCity,Hebei,Zhangjiakou075041,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Jianshenbupi prescription on hematopoietic function in rats with aplastic anemia (AA),and to explore its action mechanisms.MethodsA total of 40 Wistar rats (SPF) were randomly divided into four groups:blank control group,model group, positive control group and Jianshenbupi prescription group (observation group),with 10 rats in each group. Except for the rats in blank control group, The rats models with AA were established by giving 5-fluorouracil combined with Maryland by gavage.After successful modeling, the rats in observation group were given Jianshenbupi prescription by gavage,and the rats in positive control group were given stanozolol suspension by gavage, and the rats in blank control group and model group were given the same volume of normal saline,for two weeks. And the peripheral blood cells and bone marrow monouclear cells were counted,and the T cell subsets in peripheral blood, serum cytokines, bone marrow cell cycle, PI and the expression levels of autophagy and apoptosis related proteins were detected.ResultsThe levels of Hb, Ret, WBC, PLT, CD3+, CD4+, Treg, CD4+/CD8+, and the serum levels of IL-11, red cells and megakaryocytes, the proportion of S and G2/M phase cells, PI and the expression levels of LC3-Ⅱ and Bcl-2 proteins in positive control group and observation group were significantly higher than those in model group, however,the levels of CD8+, serum level of IL-2 and TNF-α, the proportion of lymphocytes, the proportion of G0/G1 phase cells and the expression levels of caspase-3 and PARP proteins in positive control group and observation group were significantly lower than those in model group (P<0.05).ConclusionJianshenbupi prescription can improve the hematopoietic function and immune function of rats with AA , and its action mechanism may be related to the promotion of bone marrow autophagy.

【Keywords】 Jianshenbupi prescription; aplastic anemia; hematopoietic function

再生障礙性貧血(AA)是一種臨床常見(jiàn)的骨髓造血衰竭性疾病，患者由于造血干細(xì)胞質(zhì)的缺陷或數(shù)量減少導(dǎo)致骨髓增生極度減低和外周血全血細(xì)胞減少[1-3]。目前，AA的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但研究發(fā)現(xiàn)AA發(fā)生發(fā)展與免疫失調(diào)和細(xì)胞因子分泌異常密切相關(guān)[4-6]。近年來(lái)，自噬在AA、骨髓增生異常綜合征(MDS)等血液系統(tǒng)疾病中的作用越來(lái)越受到重視。本課題組通過(guò)建立AA大鼠模型，觀察健脾補(bǔ)腎方對(duì)AA大鼠造血功能的影響，并從自噬角度探討其發(fā)揮治療作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體重(272.78±30.66)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]。

1.2 藥品 健脾補(bǔ)腎方組成：黃芪24 g，女貞子15 g，太子參24 g，白術(shù)芍15 g，炒丹皮15 g，制半夏10 g，小薊草15 g，菟絲子24 g，炒枳殼10 g，炙甘草6 g。上述藥物加水浸泡1 h，水量加至藥材的8倍，煎煮1 h，共2次，合并2次煎煮后水煎液，過(guò)濾，濃縮至2 g/ml。陽(yáng)性對(duì)照藥物司坦唑醇片購(gòu)自廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.3 試劑與儀器 ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。兔抗LC3-Ⅱ、Bcl-2、caspase-3、PARP、β-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。2000I型全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀購(gòu)自日本希思美康。EPICS XL型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。Chemi DocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Biorad公司。Multiskan FC型酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及模型建立：40只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組，每組10只。除空白組外，其余3組采用腹腔注射氟尿嘧啶(0.15 g/kg)和灌胃馬利蘭溶解液(0.015 g/kg)的方法制作AA大鼠模型[7]。造模成功后，健脾補(bǔ)腎方組每天按劑量19.2 ml/kg灌胃給予健脾補(bǔ)腎方，陽(yáng)性對(duì)照組每天按劑量4 mg/kg灌胃給予司坦唑醇混懸液，空白組和模型組灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)給藥2周。

1.4.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.2.1 外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)：10%水合氯醛麻醉大鼠后，股動(dòng)脈取血，采用全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀檢測(cè)外周血血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)。

1.4.2.2 外周血T淋巴細(xì)胞亞群：流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD3+、CD4+、CD8+、Treg細(xì)胞比例，計(jì)算CD4+/CD8+。

1.4.2.3 血清細(xì)胞因子：采用ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定血清白介素2(IL-2)、白介素11(IL-11)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。

1.4.2.4 骨髓有核細(xì)胞數(shù)：100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)骨髓紅系、粒系、淋巴細(xì)胞比例及巨核細(xì)胞數(shù)。

1.4.2.5 骨髓有核細(xì)胞周期：末次給藥后24 h，斷頸處死大鼠，取出股骨，PBS沖出骨髓細(xì)胞，200目濾網(wǎng)過(guò)濾后加入1 ml 4%冰乙酸，2 500 r/min離心30 min，棄上清，1640液沖洗2次，制成單個(gè)骨髓細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)。

1.4.2.6 骨髓細(xì)胞自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：采用Western blot檢測(cè)骨髓細(xì)胞LC3-Ⅱ、Bcl-2、caspase-3、PARP蛋白表達(dá)。提取骨髓細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性一抗(1∶5 000稀釋)，4℃過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔 IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，PBS洗膜3次，以GAPDH為內(nèi)參照基因，ECL反應(yīng)，采用Image-Pro Plus軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 4組外周血Hb、RBC、WBC、PLT比較 與空白組比較，模型組外周血Hb、Ret、WBC、PLT水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組外周血Hb、RBC、WBC、PLT水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組外周血Hb、RBC、WBC、PLT比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 4組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較 與空白組比較，模型組外周血CD3+、CD4+、Treg細(xì)胞比例及CD4+/CD8+均明顯降低，CD8+細(xì)胞比例均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組外周血CD3+、CD4+、Treg細(xì)胞比例及CD4+/CD8+均明顯升高，CD8+細(xì)胞比例均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 4組血清細(xì)胞因子比較 與空白組比較，模型組血清IL-11水平均明顯降低，IL-2、TNF-α水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組血清IL-11水平均明顯升高，IL-2、TNF-α水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 4組外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 4組血清細(xì)胞因子比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4 4組骨髓有核細(xì)胞數(shù)比較 與空白組比較，模型組骨髓紅系比例、粒系比例、巨核細(xì)胞數(shù)均降低，淋巴細(xì)胞比例均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組骨髓紅系比例、粒系比例、巨核細(xì)胞數(shù)均升高，淋巴細(xì)胞比例均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 4組骨髓有核細(xì)胞數(shù)比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.5 4組骨髓有核細(xì)胞周期、PI比較 與空白組比較，模型組骨髓細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例均明顯升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例、PI均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組G0/G1期細(xì)胞比例均明顯降低，S期和G2/M期細(xì)胞比例、PI均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 4組骨髓有核細(xì)胞周期、PI比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.6 4組骨髓細(xì)胞自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與空白組比較，模型組骨髓細(xì)胞LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯降低，caspase-3、PARP蛋白表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯升高，caspase-3、PARP蛋白表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 4組骨髓細(xì)胞自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

AA是由理化因素、病毒感染等多種因素引起的造血干細(xì)胞缺陷、造血微環(huán)境損傷和免疫失調(diào)，從而導(dǎo)致骨髓造血功能障礙，同時(shí)造血調(diào)控因子分泌異常，骨髓造血干細(xì)胞過(guò)度凋亡等[8]。中醫(yī)藥治療AA具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能夠明顯促進(jìn)骨髓造血功能恢復(fù)，并改善機(jī)體免疫功能。本研究基于AA“腎虛、血瘀”的病理機(jī)制，采用健脾補(bǔ)腎方治療AA大鼠，觀察其對(duì)骨髓造血功能的影響，并進(jìn)一步探討其治療機(jī)制。

AA主要由于骨髓紅系造血干細(xì)胞或造血微環(huán)境損傷引起，表現(xiàn)為外周全血細(xì)胞數(shù)量減少和骨髓造血細(xì)胞功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組外周血Hb、Ret、WBC、PLT水平、骨髓紅系比例、粒系比例、巨核細(xì)胞數(shù)均明顯低于空白組，淋巴細(xì)胞比例均明顯高于空白組，說(shuō)明氟尿嘧啶和灌胃馬利蘭溶解液聯(lián)合給藥能夠顯著破壞外周血細(xì)胞，抑制骨髓造血功能。而健脾補(bǔ)腎方組和陽(yáng)性對(duì)照組外周血Hb、Ret、WBC、PLT水平、骨髓紅系比例、粒系比例、巨核細(xì)胞數(shù)均明顯高于模型組，淋巴細(xì)胞比例均明顯低于模型組，提示健脾補(bǔ)腎方對(duì)AA大鼠外周血象和骨髓造血功能有顯著改善作用。此外，骨髓細(xì)胞在周期不同時(shí)相的比例是反映細(xì)胞增殖和造血功能狀況的重要指標(biāo)之一。本研究中，模型組骨髓細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例均明顯高于空白組，S期和G2/M期細(xì)胞比例、PI均明顯低于空白組，表明模型組大鼠骨髓細(xì)胞阻滯于G0/G1期，細(xì)胞凋亡明顯增加，因而骨髓造血功能顯著被抑制。而陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組G0/G1期細(xì)胞比例均明顯低于空白組，S期和G2/M期細(xì)胞比例、PI均明顯高于空白組，說(shuō)明健脾補(bǔ)腎方能夠解除AA大鼠細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖，改善骨髓造血功能。

研究表明，免疫異常引起骨髓造血干細(xì)胞損傷是AA發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制，主要表現(xiàn)為外周血淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)與造血負(fù)調(diào)控因子分泌增加[9-11]。Treg細(xì)胞是一類(lèi)具有免疫抑制作用的T淋巴細(xì)胞亞群，能夠抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖及細(xì)胞因子的分泌，并對(duì)NK細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞功能發(fā)揮調(diào)控作用[12]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AA患者外周血和骨髓中Treg細(xì)胞數(shù)量減少和功能損傷，導(dǎo)致其免疫耐受作用降低，從而引起T淋巴細(xì)胞過(guò)度活化和骨髓造血抑制[13-15]。本研究結(jié)果顯示，模型組外周血CD3+、CD4+、Treg細(xì)胞比例、CD4+/CD8+及血清IL-11水平均明顯低于空白組，外周血CD8+及血清IL-2、TNF-α水平均明顯高于空白組，提示AA大鼠存在免疫功能紊亂。而陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組外周血CD3+、CD4+、Treg細(xì)胞比例、CD4+/CD8+及血清IL-11水平均明顯高于模型組，外周血CD8+及血清IL-2、TNF-α水平均明顯低于模型組，說(shuō)明健脾補(bǔ)腎方能夠改善AA大鼠免疫功能紊亂，從而減輕其對(duì)骨髓造血功能的抑制。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，自噬基因Atg7缺陷的小鼠存在胚胎發(fā)育和造血功能障礙[16]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，AA患者造血干/祖細(xì)胞自噬水平較健康人顯著降低，且經(jīng)治療后隨著病情緩解自噬水平逐漸升高[17]。目前認(rèn)為，自噬缺陷可能引起造血干細(xì)胞增殖和分化異常、造血微環(huán)境損傷及免疫環(huán)境紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致AA發(fā)生發(fā)展。本研究模型組骨髓細(xì)胞LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯低于空白組，caspase-3、PARP蛋白表達(dá)均明顯高于空白組，提示AA大鼠存在自噬缺陷。而陽(yáng)性對(duì)照組和健脾補(bǔ)腎方組LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯高于模型組，caspase-3、PARP蛋白表達(dá)均明顯低于模型組，說(shuō)明健脾補(bǔ)腎方可能通過(guò)調(diào)控自噬抑制骨髓細(xì)胞凋亡，這可能是其發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一。

綜上所述，健脾補(bǔ)腎方能夠顯著改善AA大鼠外周血象和免疫功能紊亂，促進(jìn)骨髓造血功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與促進(jìn)骨髓細(xì)胞自噬有關(guān)。但是，自噬在AA發(fā)病中的具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，這對(duì)于預(yù)防和治療AA具有重要意義。