趙夢川 吳勇 黃迎彬 王樂 郭巍巍 楊碩 嚴(yán)小桐 李貴霞 馮志山

肺炎是兒童尤其是嬰幼兒常見的呼吸道感染性疾病，在全世界范圍內(nèi)有很高的發(fā)病率和病死率。據(jù)WHO資料顯示，肺炎目前仍然是全球5歲以下兒童死亡的首要原因[1]，全球每年有數(shù)百萬兒童死于肺炎[2,3]。兒童肺炎易反復(fù)遷延,治療不得當(dāng)會引發(fā)重癥肺炎[4]。重癥肺炎是肺炎同時存在其他臟器的功能紊亂、衰竭以及并發(fā)癥狀的兒科危重癥疾病，具有發(fā)病迅速、病情嚴(yán)重等臨床特點(diǎn)，病死率為20%～30%，是發(fā)展中國家5歲以下兒童死亡的重要原因之一[5]。細(xì)菌、病毒及肺炎支原體是兒童肺炎的常見病原體，既往多認(rèn)為細(xì)菌是導(dǎo)致重癥肺炎的主要病原體之一；而眾多的國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)流感病毒、呼吸道合胞病毒(HRSV)、腺病毒(HADV)等呼吸道病毒也可導(dǎo)致重癥肺炎[4-7]。故充分了解兒童重癥肺炎的病原體分布情況及流行病學(xué)特點(diǎn)，對其臨床診斷、合理用藥及預(yù)防控制至關(guān)重要。目前，河北省重癥肺炎患兒非細(xì)菌性呼吸道病原體感染情況尚不清楚。因此，為進(jìn)一步了解近年來河北省兒童重癥肺炎的呼吸道病原感染情況，我們分析了2 481例于河北省兒童醫(yī)院住院治療的重癥肺炎患兒非細(xì)菌性呼吸道病原體的檢出情況，并結(jié)合患兒年齡、發(fā)病季節(jié)，分析本地區(qū)兒童重癥肺炎的病原學(xué)特征，研究結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1 調(diào)查對象 以河北省兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科2016年1月至2017年12月2 481例診斷為重癥肺炎的患兒為研究對象。其中男1 509例，女972例，男女比例為1.55∶1， 年齡分布為1個月～13歲，其中1～12個月(含12月)1 519例，占61.23%,1～3歲679例，占27.37%，4～6歲173例，占6.97%，≥7歲110例，占4.43%。

1.2 重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)會呼吸分組重癥肺炎的標(biāo)準(zhǔn)[8]:(1)一般情況差；(2)有拒食或脫水征；(3)有意識障礙；(4)呼吸頻率明顯增快(嬰兒RR>70次/min，年長兒RR>50次/min)；(5)有發(fā)紺；(6)有呼吸困難(呻吟、鼻翼扇動、三凹征)；(7)多肺葉或≥2/3的肺受累；(8)有胸腔積液；(9)脈搏血氧飽和度≤0.92；(10)有肺外并發(fā)癥。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與儀器:核酸提取試劑盒和13種呼吸道病原體多重檢測試劑盒(PCR毛細(xì)電泳片段分析法)購自寧波海爾施基因科技有限公司；全自動核酸提取儀Smart LabAssist-32購自臺灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)股份有限公司； GenomeLabTM GeXP遺傳分析系統(tǒng)購于美國貝克曼庫爾特有限公司；PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司。

1.3.2 標(biāo)本采集與處理:在患兒入院24 h內(nèi)使用吸痰器(參照吸痰器的使用說明書進(jìn)行操作)采集其深部氣道吸取物，加1 ml 0.9%氯化鈉溶液，充分混勻后用于病原體核酸提取。樣本采集和運(yùn)送過程中應(yīng)避免污染。

1.3.3 核酸提取:使用“核酸提取試劑”在全自動核酸提取儀Smart LabAssist-32上進(jìn)行自動核酸提取。

1.3.4 常見非細(xì)菌性呼吸道病原體檢測:使用多重RT-PCR方法[9]同時檢測甲型流感病毒(InfA)、甲型流感病毒H1N1(09H1)、季節(jié)性H3N2病毒(H3)、乙型流感病毒(InfB)、HADV、博卡病毒(Boca)、鼻病毒(HRV)、副流感病毒(HPIV)、衣原體(Ch)、偏肺病毒(HMPV)、肺炎支原體(Mp)、冠狀病毒(HCOV)和HRSV，具體操作步驟如下：①根據(jù)試劑說明書配制PCR擴(kuò)增體系；②在PCR儀上編輯如下擴(kuò)增程序并進(jìn)行擴(kuò)增：25℃，5 min，1個循環(huán)；50℃，15 min，1個循環(huán)；95℃，2 min，1個循環(huán)；94℃，30 s，65→60℃，30 s，72℃，60 s(65→60°C，1℃降落退火，共6個循環(huán))；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，60 s(29個循環(huán))；72℃，10 min，1個循環(huán)；4℃保存至電泳。③選擇“Fragment”電泳方法，在GenomeLabTM GeXP遺傳分析系統(tǒng)上進(jìn)行PCR產(chǎn)物的毛細(xì)電泳分離(詳見GenomeLabTM GeXP遺傳分析系統(tǒng)操作說明)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料的分析采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非細(xì)菌性呼吸道病原體檢出情況 在2 481份呼吸道標(biāo)本中，2 049份非細(xì)菌性病原體檢測陽性，檢出率為82.59%。病毒檢出1 944例次，檢出率為78.36%，其中檢出率最高的是HRV，為814例次(32.81%)，其次為HRSV 712例次(28.70%)和HPIV 255例次(10.28%)。非典型病原體共檢出216(8.70%) 例次，其中Mp 170例次(6.85%)，Ch 46 例次(1.85%)。見表1。

2.2 混合感染檢出情況 2 049份病原體檢測陽性的標(biāo)本中，546份(21.93%)至少有2種或2種以上病原體混合感染，其中483份檢出2種病原體(表1)，59份標(biāo)本中檢出3種病原體，4份標(biāo)本中檢出4種病原體(表2)。814份HRV陽性標(biāo)本有406份(49.88%)檢出其他病原體， HRSV、HPIV、Mp、FluA、HADV、FluB、HCOV、Boca、HMPV和Ch陽性標(biāo)本中分別有31.04%(221/712)、40.39%(103/255)、48.82%(83/170)、34.73%(58/167)、63.27%(93/147)、32.77%(39/119)、62.96%(51/81)、67.53%(52/77)、32.88%(24/73)和60.87%(28/46)檢出其他病原體。見表2。

2.3 非細(xì)菌性呼吸道病原體的季節(jié)分布 春季和冬季病原體總檢出率高于夏季和秋季，且冬季混合感染率亦高于夏季和秋季，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 13種常見非細(xì)菌性呼吸道病原體的檢出情況(檢出例數(shù)) 例

表2 混合感染分布情況

此外，不同呼吸道病毒的季節(jié)差異則各有特點(diǎn)：HRSV秋季和冬季檢出率明顯高于其他季節(jié)(P<0.05)；Boca在秋季檢出率最高，其次為冬季；HPIV夏季和秋季檢出率較高；HADV春季和夏季檢出率較高；FluA和HMPV春季檢出率明顯增高；HRV在春季檢出率低于其他季節(jié)；HCOV冬季檢出率低于其他季節(jié)；FluB檢出率極低，但在2016年春季出現(xiàn)了感染高峰。非典型病原體中，Mp秋季檢出率高于其他季節(jié)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Ch秋季檢出率亦略高于其他季節(jié)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 非細(xì)菌性呼吸道病原體的季節(jié)分布情況 例(%)

注：與春季比較，*P<0.05；與夏季比較，#P<0.05；與秋季比較，△P<0.05

2.4 非細(xì)菌性呼吸道病原體的年齡分布 1～3歲年齡組患兒的病原體總檢出率和混合感染率最高，其次是1～12個月年齡組、4～6歲年齡組和≥7歲年齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外，不同病原體在各年齡段的檢出情況不同(除HCOV外)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)：HRV在1～3歲年齡組檢出率最高，其次在1～12個月年齡組也有較高的檢出率；HRSV在1～12個月年齡組的檢出率明顯高于其他3個年齡組(P<0.05)；HPIV在1～12個月年齡組檢出率最高，其次是1～3歲年齡組；InfA和InfB在4～6歲年齡組的檢出率最高；HADV在1～3歲和4～6歲年齡組的檢出率高于1～12個月和≥7歲年齡組；HCOV在1～12個月和1～3歲年齡組檢出率較高；Boca在1～3歲年齡組的檢出率最高，其次是1～12個月年齡組，在4～6歲和≥7歲年齡組未檢出Boca；HMPV在4～6歲年齡組的檢出率最高，其次是1～3歲年齡組； Mp在≥7歲年齡組的檢出率明顯高于其他3個年齡組(P<0.05)，Ch在1～12個月年齡組檢出率最高。見表4。

表4 不同年齡段兒童重癥肺炎非細(xì)菌性呼吸道病原體的分布情況 例(%)

注：與1～12月比較，*P<0.05；與1～3歲比較，#P<0.05；與4～6歲比較，△P<0.05

3 討論

病毒、細(xì)菌和非典型病原體均可引起兒童重癥肺炎，且存在混合感染[7,10-12]。近幾年，隨著分子診斷學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與應(yīng)用，國內(nèi)外已有較多報道證實(shí)病毒是重癥肺炎患兒的主要病因：van de Pol等[7]在入住PICU的急性下呼吸道感染患兒中采用熒光定量PCR檢測病毒，其檢出率高達(dá)96%。陳玉等[12]采集重癥肺炎患兒的痰液、咽拭子和靜脈血，分別采用病原菌培養(yǎng)、RT-PCR和間接免疫熒光法檢測細(xì)菌、病毒和肺炎支原體，結(jié)果提示病原檢測陽性率為86.65%，其中病毒感染最多見，陽性率為37.32%。本研究對2 481例重癥肺炎患兒的下呼吸道分泌物進(jìn)行了13種常見非細(xì)菌性呼吸道病原體的檢測，檢出率為82.59%，提示非細(xì)菌性呼吸道病原體是本地區(qū)兒童重癥肺炎的重要病原體；其中9種常見呼吸道病毒此次均有檢出，總檢測率為78.36%，高于我國貴陽、重慶等地[13,14]，分析原因可能是本研究采用的檢測方法為敏感性較高的多重RT-PCR，且檢測的病毒種類比較多；病毒中HRV的檢出率最高，其次為HRSV和HPIV，而重慶、貴陽等地的研究未將HRV納入檢測范圍，故這些地區(qū)兒童重癥肺炎的主要病毒病原仍是HRSV；此次研究共檢出非典型病原體216(8.70%) 例次，包括肺炎支原體170例次(6.85%)和衣原體 46 例次(1.85%)，檢出率高于重慶地區(qū)[15]，但低于貴陽地區(qū)[13]。

混合感染是導(dǎo)致兒童肺炎的重要原因之一，而且與單獨(dú)細(xì)菌或者病毒感染相比，混合感染可導(dǎo)致更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及臨床表現(xiàn)[10]。本研究中重癥肺炎患兒的混合感染率為29.1%，高于本地區(qū)急性下呼吸道感染患兒的混合感染率(23.75%)[16]，說明混合感染可能是重癥肺炎的危險因素之一?；旌细腥局?8.5%為雙重感染，以HRV合并HRSV感染最常見。有報道稱兒童重癥肺炎的混合感染以病毒合并細(xì)菌感染多見[13,15]，而本研究中，因不能排除患兒入院前經(jīng)抗生素治療的可能，未將細(xì)菌納入檢測范圍，故推測本地區(qū)重癥肺炎患兒的混合感染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于29.1%，建議兒科醫(yī)生提高對重癥肺炎患兒多病原體檢測的關(guān)注。

呼吸道病毒感染多具有明顯的季節(jié)性，本研究中，冬春季病原體總檢出率高于夏秋兩季，與以往研究結(jié)果[16]一致。而且，不同呼吸道病毒流行具有不同的季節(jié)性差異，HRSV、InfA、 InfB、HADV和HCOV OC43/HKU1主要流行季節(jié)為冬春季,HCOV 229E/NL63、HMPV主要流行季節(jié)為冬季，HRV流行季節(jié)為春秋季，HPIV3流行季節(jié)為春夏季，Boca流行季節(jié)為夏冬季[16-19]。本研究中，HRSV秋冬季檢出率較高，Boca在秋季檢出率最高，HPIV夏秋季檢出率較高，HADV春夏季檢出率較高，F(xiàn)luA、FluB和HMPV春季檢出率明顯增高，HRV在春季檢出率低于其他季節(jié)，HCOV冬季檢出率低于其他季節(jié)，與王勝娥等[16]的報道存在一定差異，分析本研究對象為重癥肺炎患兒，王勝娥等的報導(dǎo)研究對象為急性下呼吸道感染患兒，而非單純重癥，說明本地區(qū)重癥肺炎患兒呼吸道病毒的季節(jié)分布規(guī)律可能與非重癥肺炎患兒不同。

本研究中，1～12月嬰兒占61.23%，1～3歲幼兒占27.37%，可見兒童重癥肺炎主要發(fā)生在嬰幼兒時期。此外，本研究發(fā)現(xiàn)1～12月和1～3歲年齡組中，呼吸道病毒的檢出率較高，而4歲及以上患兒中，Mp的檢出率較高，與以往報道[10,16,20,21]一致。以往的研究發(fā)現(xiàn)HRV是石家莊地區(qū)5歲以上兒童急性下呼吸道感染的首要病毒病原，而本研究中，HRV在1～3歲年齡組檢出率最高，其次是1～12月年齡組，說明HRV是導(dǎo)致本地區(qū)嬰幼兒重癥肺炎的重要病原之一。國內(nèi)不同地區(qū)的病原學(xué)研究結(jié)果顯示 HRSV 是兒童急性下呼吸道感染中最重要的病原體[22]，也是兒童重癥 CAP 的首位病毒病原[13]。本研究中HRSV是1～12月年齡組患兒中檢出率最高的病毒病原，與以往研究結(jié)果一致，說明HRSV是導(dǎo)致小嬰兒重癥肺炎的重要病原體。HADV可引起兒童重癥肺炎的暴發(fā)流行[23]，可導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部后遺癥[24]，有一定的病死率(<5%)[25]。本研究中HADV在1～3歲和4～6歲年齡組的檢出率最高，InfA和InfB在4～6歲年齡組的檢出率最高，與北京地區(qū)研究結(jié)果[26]一致。與國內(nèi)多數(shù)地區(qū)報道[13,16,26]一致，本研究中，HPIV、Boca及近年新發(fā)現(xiàn)的HCOV在3歲以下嬰幼兒中檢測率最高，是本地區(qū)嬰幼兒重癥肺炎的重要病毒病原體。HMPV亦是近年新發(fā)現(xiàn)的呼吸道病毒，謝正德等報道北京地區(qū)HMPV在1～<3歲組的檢測率最高，王勝娥[16]報道石家莊地區(qū)HMPV感染主要集中在 2～4 歲，本研究中HMPV在4～6歲年齡組的檢出率最高，其次是1～3歲年齡組，存在的差異可能與研究地區(qū)及研究對象的不同有關(guān)。

綜上所述，本研究對本地區(qū)兒童重癥肺炎明確病原體結(jié)果前的經(jīng)驗(yàn)性治療及早期病原體診斷具有重要的指導(dǎo)及參考意義。