張鵬 徐洪燕 孫勇

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，已成為女性健康的主要威脅。乳腺癌的治療方法主要為手術(shù)，化學(xué)療法，放射療法，分子靶向療法和內(nèi)分泌治療的組合療法[1-3]。然而，即使根據(jù)NCCN指南給予治療，20%～40%的乳腺癌患者仍然患有疾病復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性?；煵幻舾惺侨橄侔┻M展的最重要因素之一。多西他賽、表柔比星、環(huán)磷酰胺常聯(lián)合用于乳腺癌化療，其易導(dǎo)致化療化療不敏感引起乳腺癌的復(fù)發(fā)和進展[4,5]。Sox2是性別決定區(qū)Y相關(guān)的高遷移率族盒(sex-determining region Y-related high-mobility group box，SOX)基因家族的成員，并且已被發(fā)現(xiàn)在各種腫瘤中充當癌基因。研究表明Sox2在肝癌組織中上調(diào)并促進肝癌的發(fā)展，并且原癌基因C-fos通過靶向Sox2來促進乳肝癌的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移[6,7]。ABCC5是ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)超家族的成員，是一種ATP依賴性轉(zhuǎn)運蛋白，其顯著降低了化療藥物的細胞內(nèi)濃度，這被廣泛認為是化療敏感性最常見的潛在基礎(chǔ)，此外ABCC5已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中相對于原發(fā)性乳腺腫瘤過度表達。研究還表明，ABCC5高表達的患者預(yù)后較差。在細胞試驗中，發(fā)現(xiàn)ABCC5與培美曲塞對乳腺癌化療耐藥有顯著相關(guān)性，轉(zhuǎn)染ABCC5的乳腺癌細胞表現(xiàn)出化療不敏感特性[8,9]。本研究擬探討Sox2和ABCC5在乳腺癌中表達及與化療敏感性的關(guān)系，為乳腺癌的早期診斷及治療提供理論臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年3月至2015年8月在我院行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的乳腺癌患者136例，符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012 版《NCCNCRC診治指南》中的診斷標準[10]。手術(shù)切除標本后行病理檢查以判定臨床病理特征。同時取距乳腺癌組織>5 cm的正常乳腺組織為癌旁組?；颊咦栽柑峁┤橄侔┘罢Ｈ橄俳M織，用作分析Sox2、ABCC5 mRNA、蛋白的表達及與與臨床病理特征的關(guān)系。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:①患者術(shù)前未接受任何放、化療；②所有患者(或患者直系親屬)簽署知情同意書；③所有患者的預(yù)計生存期均>3 個月。

1.2.2 排除標準：①治療期間，同步接受其他腫瘤化放療的患者；②病史及隨訪資料不完整。本研究經(jīng)濟南市人民醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.3 Sox2、ABCC5 mRNA水平的測定 根據(jù)制造商的方案，使用TRIzol Reagent(Life Technologies)提取總RNA。使用ReverTra Ace-αqPCRRT試劑盒(Toyobo，Japan)定量RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(Tiangen，Beijing，China)進行成熟miRNA的RT-PCR。 qRTPCR擴增方案根據(jù)ABRE7500 Fast系統(tǒng)上SYBR?GreenRealtime PCR Master Mix(Toyobo，Japan)的用戶指南進行。熔解曲線分析用于監(jiān)測PCR產(chǎn)物的特異性。GAPDH用作對照。Sox2引物如下：正向，5’-GGACGTTCACAACCACACTG-3’;反向，5’-TCCCACTTTGGCATTCTAGG-3’Sangon Biotech，中國上海。ABCC5引物如下：正向，5’-CCAAGAAGTGTGGTGTCCTG-3’;反向，5’-ACAAAGTCGTAGGCGTCGTT-3’(Sangon Biotech，中國上海)。 GAPDH引物如下：正向，5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3’;反向，5’-TCTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。所有實驗一式三份進行。分析qRT-PCR結(jié)果并表示為CT的相對miRNA或mRNA水平(循環(huán)閾值)值，然后將其轉(zhuǎn)換為倍數(shù)變化，使用閾值循環(huán)(Ct)的值確定每個靶基因的mRNA表達。在與GAPDH比較后使用2-ΔΔCT方法計算相對表達。

1.4 免疫組織化學(xué)法測定Sox2、ABCC5的表達 EnVision兩步法用于免疫組織化學(xué)法。將5 μm切片脫蠟至水，并在洗滌后用0.3%過氧化氫甲醇處理10 min。然后將切片置于微波爐中，用兔抗人Sox2(1∶80稀釋)，ABCC5(1∶80稀釋)多克隆抗體，進行抗原修復(fù)20 min，連續(xù)加入Sox2(1∶50稀釋)和ABCC5(1∶50稀釋)單克隆抗體。所有材料均購自Abcam(Cambridge，MA，USA)。將第一抗體置于4℃過夜，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，每次2 min。然后用自來水洗滌切片，用蘇木精復(fù)染10 min(70%～100%)水平的醇脫水，每個水平3 min。之后，將切片置于二甲苯中5 min，最后安裝并在顯微鏡下觀察。PBS緩沖液用作陰性對照而不是第一抗體，乳腺癌陽性樣品(北京中山金橋公司中國北京)用作陽性對照。在半定量評估中考慮百分比和強度，并分別計數(shù)上皮細胞和基質(zhì)細胞。陽性細胞的百分比評分為0(0陽性細胞)，1(1%～25%陽性細胞)，2(26%～50%陽性細胞)，3(51%～75%陽性細胞)，或4(>75%陽性細胞)。Sox2、ABCC5免疫染色的強度評分為0(陰性)，1(弱)，2(中間)和3(強)。強度得分(0～3)乘以百分比得分(0～4)，最終得分為0(陰性)，1～4(弱表達)，5～8(中度表達)和9～12 (強烈表達)。評分為0～4的樣品被認為是低表達，而評分為5～12的樣品被認為是高表達的統(tǒng)計分析。所有組織切片的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)由三名評估員評估，平均值為最終評分。

1.5 ELISA測定Sox2、ABCC5蛋白水平 4℃下常規(guī)制作正常乳腺、乳腺癌組織勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Sox2、ABCC5 ELISA試劑盒購于北京九洲天瑞科技有限公司)檢測正常乳腺組織、乳腺癌組織勻漿中Sox2、ABCC5蛋白表達量。

1.6 化療方案 化療方案為多西他賽75 mg/m2(第1天)、表柔比星100 mg/m2(第3天)、環(huán)磷酰胺500 mg/m2靜脈滴注(第7天)，7 d 為1個周期，共18個周期。

1.7 乳腺癌化療敏感性判定 進展(PD)：有新病灶出現(xiàn)或腫瘤最大橫徑與縱徑乘積增大25%以上；穩(wěn)定(SD)：無有新病灶出現(xiàn)且腫瘤最大橫徑與縱徑乘積增大不超過25%，縮小<50%；部分緩解 (PR)：腫瘤最大橫徑與縱徑乘積縮小>50%；完全緩解(CR)：腫瘤消失。低敏感組為 SD+PD；高敏感組為 CR+PR。本文高敏感患者75例，低敏感患者61例。

1.8 隨訪 隨訪起始日期為術(shù)后第1天，隨訪截止日期為2018年8月31日。隨訪方式為電話隨訪，隨訪內(nèi)容為：生存質(zhì)量、病情變化、治療效果、恢復(fù)情況等。

2 結(jié)果

2.1 癌旁組、乳腺癌組中Sox2、ABCC5 mRNA水平的表達 乳腺癌組Sox2 mRNA、ABCC5 mRNA表達水平高于癌旁組 (t=19.326、12.326，P<0.05)。見表1。

表1 癌旁組、乳腺癌組中Sox2、ABCC5 mRNA水平的表達

2.2 Sox2、ABCC5在癌旁組、乳腺癌組中的免疫組化表達評分及陽性率 Sox2 主要定于細胞膜和細胞質(zhì)，呈黃色或深棕黃色顆粒，ABCC5 陽性為細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒；乳腺癌組Sox2陽性102例、ABCC5陽性106例，乳腺癌組Sox2、ABCC5陽性率高于癌旁組(χ2=118.708、24.901，P<0.05)；乳腺癌組Sox2、ABCC5蛋白表達評分高于癌旁組(t=15.903、24.091，P<0.05)。見表2，圖1。

表2 Sox2、ABCC5在癌旁組、乳腺癌組中的免疫組化表達評分及陽性率 n=136,例(%)

圖1 Sox2、ABCC5在癌旁組、乳腺癌組的表達;A Sox2在癌旁組中表達；B Sox2在乳腺癌組中表達;C ABCC5在癌旁組中表達；D ABCC5在乳腺癌組中表達(免疫組化×200)

2.3 癌旁組、乳腺癌組中Sox2、ABCC5蛋白水平的表達 乳腺癌組Sox2、ABCC5蛋白表達水平高于癌旁組(t=113.821、88.774，P<0.05)。見表3。

2.4 Sox2、ABCC5蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 Sox2、ABCC5蛋白表達與年齡相關(guān)性不明顯(χ2=0.348、2.429，P>0.05)；與腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TMN分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，Sox2、ABCC5蛋白陽性表達率越高(χ2=21.889、17.231、32.026、24.764、49.788、13.782、23.791、15.460、19.436、20.424、17.352、15.631，P<0.05)。見表4。

表3 癌旁組、乳腺癌組中Sox2、ABCC5蛋白水平的表達

2.5 Sox2、ABCC5蛋白表達與化療敏感性的關(guān)系 Sox2、ABCC5蛋白表達與化療敏感性相關(guān)性明顯，且化療敏感性越低，Sox2、ABCC5蛋白陽性表達率越高(χ2=36.560、15.460，P<0.05)。見表5。

表4 Sox2、ABCC5蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

表5 Sox2、ABCC5蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.6 Sox2、ABCC5蛋白表達水平與乳腺癌患者預(yù)后分析 Sox2、ABCC5陰性組3年生存率及生存期均明顯高于Sox2、ABCC5陽性組(χ2=35.211、37.816、Z=17.954、18.065，P<0.05)。見表6，圖2。

表6 Sox2、ABCC5蛋白表達水平與乳腺癌患者預(yù)后分析

圖2 Sox2、ABCC5 陽、陰組 Kaplan-Meier生存曲線分析

3 討論

Sox2表達失常已經(jīng)涉及許多嚴重的臨床疾病，包括人類癌癥。功能獲得和功能喪失實驗均表明Sox2在體外和體內(nèi)有助于肝癌細胞增殖和致瘤性質(zhì)，而在細胞水平，Sox2通過促進G1至S轉(zhuǎn)變促進細胞周期進展[11]。Sox2是含有HMG結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，通過其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)發(fā)揮其生物學(xué)活性。γ-晶狀體蛋白、成纖維細胞生長因子4(fgf4)、細胞轉(zhuǎn)錄因子(UTF1)，N-cadherin和Oct3/4已被確定為Sox2的轉(zhuǎn)錄靶標基因。在這些基因中，UTF1已經(jīng)顯示出被Sox2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)并介導(dǎo)Sox2在促進細胞增殖和腫瘤發(fā)生中的作用。UTF1的蛋白質(zhì)產(chǎn)物細胞周期蛋白D1是在細胞周期的G0/G1至S轉(zhuǎn)換中起作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑之一[12]。因此，Sox2在促進G0/G1至S轉(zhuǎn)換與UTF1在細胞中擴增和(或)過表達的行為一致，是癌癥中最普遍的改變之一。Sox2在乳腺中的致癌活性已在遺傳修飾的小鼠模型中得到證實，其中UTF1過表達導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)展，而Sox2消融導(dǎo)致小鼠對幾種致癌基因誘導(dǎo)的癌癥具有抗性。此外，Sox2-null小鼠顯示出有缺陷的出生后乳房發(fā)育，這表明由于懷孕的性類固醇環(huán)境對肺泡上皮細胞的增殖缺乏所致[13]。本次研究結(jié)果顯示，乳腺癌組Sox2 mRNA表達水平、Sox2陽性率、Sox2蛋白表達評分、Sox2蛋白表達水平高于癌旁組；Sox2與腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TMN分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)性明顯，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，Sox2蛋白陽性表達率越高。這與上述討論符合，同時也提示Sox2在乳腺癌中高表達，Sox2能促進乳腺癌進展

近期研究表明，ABCC5可能作為潛在的關(guān)鍵轉(zhuǎn)移和閹割抗性相關(guān)的致癌基因，然而，其潛在的分子機制仍不清楚[14]。眾所周知，增殖和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤相關(guān)死亡的兩個最常見原因。為研究ABCC5的功能，構(gòu)建了穩(wěn)定的ABCC5沉默/過表達LNCaP和PC-3細胞系，并研究了ABCC5的敲低/過表達對細胞增殖，遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果表明ABCC5敲低可顯著抑制體外PCa細胞系的增殖，用ABCC5敲低構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后，PCa細胞變得不那么具有攻擊性和侵襲性，這表明ABCC5在PCa中起到轉(zhuǎn)移相關(guān)致癌基因的作用[15]。也提示ABCC5的沉默顯著抑制腫瘤生長和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果中，乳腺癌組ABCC5mRNA、陽性率、蛋白表達評分、蛋白表達水平高于癌旁組；且ABCC5陽性表達率與乳腺癌臨床病理特征相關(guān)明顯。這也提示，ABCC5在乳腺癌中高表達，ABCC5能促進乳腺癌進展。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，Sox2、ABCC5蛋白表達與化療敏感性相關(guān)性明顯，且化療敏感性越低，Sox2、ABCC5蛋白陽性表達率越高。ABCC5作為關(guān)鍵的ABC轉(zhuǎn)運蛋白分子之一，能夠轉(zhuǎn)運單磷酸化的核苷類似物，可以賦予對6-巰基嘌呤，6-硫鳥嘌呤和9-(2-膦?；?甲氧基乙基)腺嘌呤的抗性[16]。此外，ABCC5也參與了抗紫外線藥物的耐藥性，該機制是基于ABCC5能特異性轉(zhuǎn)運極性膦酸鹽(6-巰基嘌呤、5-氟尿嘧啶的單磷酸鹽)至細胞外，ABCC5基因表達增加是細胞對化療不敏感的基礎(chǔ)[17,18]。本次研究結(jié)果與之符合。

綜上所述，Sox2、ABCC5在乳腺癌組織的表達量高于癌旁組織，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起促進作用；Sox2、ABCC5與化療敏感性負相關(guān)；Sox2、ABCC5陰性的患者能獲得較好的預(yù)后。