胡逸超，雷 薇，孫建生，李季剛，鄒克興，蘇 贊，梁 偉，蔡聯(lián)合，陳 琦，鄒承武

(1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣西 南寧 530001；2.南寧國拓生物科技有限公司，廣西 南寧 530001；3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)在產(chǎn)生芽孢過程中會(huì)產(chǎn)生具有生物殺蟲活性的δ-內(nèi)毒素(ICPs)或cry蛋白(crystal toxcin protein)[1]，這些毒素對(duì)范圍較廣的昆蟲具有毒殺作用，且具有較高的特異性，對(duì)環(huán)境及非靶標(biāo)生物安全，目前已廣泛用于控制農(nóng)林害蟲[2]。已有研究表明，蘇云金芽孢桿菌屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus，Bc)群，包含6個(gè)非常相近的種(B.cereus、B.anthracis、B.mycoides、B.pseudomycoides、B.weihеnstephanensis和B.thuringiensis)[3]，而細(xì)菌的經(jīng)典生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)分類方法一直未能區(qū)分蘇云金芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌[4]，制約了蘇云金芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。因此，分析蘇云金芽孢桿菌在關(guān)鍵基因序列上的遺傳多樣性并進(jìn)行詳細(xì)分類，對(duì)該菌株所攜帶的cry基因類型進(jìn)行檢測(cè)及其在農(nóng)業(yè)上的開發(fā)應(yīng)用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Bavykin等[5]研究認(rèn)為，基于對(duì)表型性狀的原核生物分類學(xué)有較大局限性，16SrRNA的基因序列是目前分析原核生物系統(tǒng)發(fā)育最廣泛應(yīng)用的基因，其對(duì)rRNA序列的分析已經(jīng)使人們對(duì)原核生物多樣性知識(shí)有了深刻了解。Yamamoto等[6]研究發(fā)現(xiàn)，gyrB基因已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定和分類的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記。gyrB蛋白的氨基酸序列比較保守，gyrB基因核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析也反映了關(guān)系較近物種的進(jìn)化關(guān)系[7-8]。在控制農(nóng)作物害蟲上，已經(jīng)證明具有cry1和cry2基因的蘇云金芽孢桿菌所產(chǎn)生的毒素對(duì)鱗翅目昆蟲有高效殺蟲活性。蘇云金芽孢桿菌的殺蟲效率是由cry基因編碼的晶體蛋白決定[9-10]。已有研究表明，cry蛋白對(duì)多種昆蟲的幼蟲呈現(xiàn)毒性活性[11]。利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和序列測(cè)定可鑒定特定的cry基因，預(yù)測(cè)蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性，發(fā)現(xiàn)新的cry基因[12]。除作為研究Bt資源的重要組成部分外，cry蛋白的類型及基因型分類有助于了解Bt的殺蟲活性[13-14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究課題組前期從廣西的多個(gè)煙葉貯藏倉庫中分離出一株具有較高煙草甲蟲毒殺活性的蘇云金芽孢桿菌(Bt)——GXZY032[15]，并對(duì)該菌株的生理生化指標(biāo)和實(shí)際殺蟲效果進(jìn)行了研究，其在煙草倉庫的煙草甲蟲害管理上具有較高的應(yīng)用價(jià)值，但針對(duì)其在蠟狀芽孢桿菌群中的進(jìn)化關(guān)系及cry基因驗(yàn)證的研究未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】對(duì)蘇云金芽孢桿菌GXZY032菌株進(jìn)行16S rRNA和gyrB基因序列進(jìn)化分析，了解該菌株在蠟狀芽孢桿菌群中的分類關(guān)系，通過對(duì)cry基因的PCR鑒定，在基因水平上驗(yàn)證該菌株的殺蟲功能，為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌株打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蘇云金芽孢桿菌(Bt) GXZY032菌株分離自廣西煙草貯藏倉庫的煙葉[15]。挑取單菌落，于LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g)28 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2 DNA提取

取1.0 mL 菌液，8000 r/min離心1 min，去除上清培養(yǎng)基，得到蘇云金芽孢桿菌菌體，按照博日科技細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Biospin，#BSC12S1)說明提取DNA。電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，NanoDrop檢測(cè)OD260/OD280后，ddH2O稀釋20倍用作PCR模板。

1.3 16S rRNA序列PCR擴(kuò)增并測(cè)序

16S rRNA序列擴(kuò)增使用的引物為：27F：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R：5′-GTTACCTTGTTACGACTT-3′[16]。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。預(yù)期的PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為1.5 kb。通過1.0 %瓊脂糖核酸電泳檢測(cè)后，使用ABI Genetic Analyzer 3730xl(Applied biosystems)進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序引物分別為27F和1492R。獲得的序列使用Vector NTI 11.0(Invitrogen)進(jìn)行拼接，所得的Contigs用于核苷酸序列分析及進(jìn)化樹分析。

1.4 gyrB基因序列PCR擴(kuò)增與測(cè)序

gyrB基因序列擴(kuò)增使用的引物為UP-1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′和UP-2r：5′-AGCAGGGTACGGATGTGC GAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′[17]。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min、65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。預(yù)期的PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為1.2 kb，通過1.0 %瓊脂糖核酸電泳檢測(cè)后，使用引物UP-1S：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′和UP-2Sr：5′-AGCAG GGTACGGATGTGCGAGCC-3′進(jìn)行雙向Sanger測(cè)序。

1.5 Cry基因檢測(cè)

參考Shishir[18]的方法進(jìn)行cry基因檢測(cè)，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度詳見表1，退火時(shí)間30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。通過1.0 %瓊脂糖核酸電泳檢測(cè)分析每種cry基因的存在情況。

1.6 進(jìn)化分析

用于進(jìn)化分析的序列包括經(jīng)測(cè)序所得的蘇云金芽孢桿菌(Bt) GXZY032的16S rRNA序列及gyrB基因序列，其他用于建樹的序列均來自美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，每條基因序列均在結(jié)果中顯示基因索引號(hào)(Accession number)。使用CLUSTALW進(jìn)行序列比對(duì)，使用Mega ediors對(duì)序列進(jìn)行編輯。使用MEGA 3.1以NJ(Neighbor Joining)和ME(Minimum Evolution)算法進(jìn)行基于核苷酸序列的進(jìn)化樹分析。其中，選擇自展值(Boostrap值)為1000進(jìn)行可信度檢驗(yàn)。

表1 用于PCR擴(kuò)增和測(cè)序的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 基于16S rRNA序列的進(jìn)化樹分析

對(duì)GXZY032菌株的16S rRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，獲得的基因片段大小為1465 bp，經(jīng)測(cè)序和BLAST比對(duì)，所測(cè)序列與Bacillusthuringiensis(GenBank accession No. KT965084.1)序列的一致性最高，達(dá)100 %。為了分析該菌株與其他芽孢桿菌的進(jìn)化關(guān)系，選取多個(gè)芽孢桿菌屬(B.cereus、B.anthracis、B.mycoides、B.pseudomycoides和B.weihenstephanensis) 代表菌株的16S rRNA序列，使用ME算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。從圖1可看出，所分離GXZY032菌株的16S rRNA序列在進(jìn)化樹中與多個(gè)BtII群的菌株聚為一支，B.cereus的兩個(gè)群B.cereusI和B.cereusII分別聚為一支，其中包含了不同Bt血清型菌株，但該分支的執(zhí)行值較低，多個(gè)數(shù)值出現(xiàn)小于50 %的置信值。B.mycoides和B.weihenstephanensis聚在一個(gè)較遠(yuǎn)的分支，且該分支的置信值為99 %。

以引物up1和up2r對(duì)GXZY032菌株的gyrB基因序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，獲得1.2 kb的目標(biāo)基因序列。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載屬于B.cereus不同群菌株的gyrB基因序列，通過比對(duì)和序列修剪，最終使用47個(gè)菌株的gyrB基因序列與GXZY032菌株的gyrB基因序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。從進(jìn)化樹的結(jié)構(gòu)可看出，BtI、BtII、B.cereusI和B.cereusII 4個(gè)群分別聚為一支，且進(jìn)化樹大分支之間的置信值均較高；GXZY032菌株以較高的置信值與BtII聚集在一個(gè)分支，與B.thuringiensisserroskildiensisIEBC-T45菌株距離最近。

2.2 Cry基因種類檢測(cè)

為了明確GXZY032菌株所具有的殺蟲相關(guān)cry基因類型，對(duì)表1中所列舉的8種cry基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳檢測(cè)，獲得的PCR產(chǎn)物大小分別為277、639和348 bp(圖3)，說明GXZY032菌株包含的cry基因主要為cry1、cry2和cry10。

3 討 論

16S rRNA序列的核苷酸序列常用于進(jìn)行菌株分類和種屬鑒定[5]。本研究以芽孢桿菌屬不同菌株的16S rRNA序列構(gòu)建進(jìn)化樹，對(duì)所分析的菌株進(jìn)行歸類，發(fā)現(xiàn)雖然B.cereus的2個(gè)群B.cereusI和B.cereusII分別聚在一個(gè)獨(dú)立分支，但這2個(gè)分支的置信度不高，在多個(gè)分支上出現(xiàn)較小數(shù)值(小于50 %)，說明這些菌株在16S rRNA序列的核苷酸序列與其他分支之間差異不明顯，可能是各分支置信度較低的原因。B.mycoides和B.weihenstephanensis聚在一個(gè)分支，這個(gè)分支的置信度較高，為99 %，且與其他菌株在遺傳距離上較遠(yuǎn)。而BtI和BtII群的菌株被混合聚在一個(gè)大分支，且置信值較低，說明這2個(gè)群的菌株在16S rRNA序列上差異較小。其中，一個(gè)典型的Bt菌株Btser.berlinerATCC 10792正好處于這個(gè)大分支中。GXZY032菌株與多株蘇云金芽孢桿菌聚在一起，說明從16S rRNA序列的水平上分析，可證實(shí)GXZY032菌株屬于蘇云金芽孢桿菌，與前期對(duì)該菌株表型分析鑒定及生理生化檢測(cè)結(jié)果一致[15]。

Bootstrap值為1000，每個(gè)枝的前部分為該序列的GenBank基因號(hào)(Accession number)，后部分為該序列的來源菌株名稱或編號(hào) The boostrap confidence value was 1000，the front part of the branch was the accession number of the sequence，the rear part was the name of strain

本研究中，基于16S rRNA序列進(jìn)行B.cereus的種屬關(guān)系分析及群類分析具有一定的可行性，一些差異較明顯的分支得到了分離，例如兩個(gè)群B.cereusI和B.cereusII在進(jìn)化樹上分別出現(xiàn)在不同的分支。另一方面，16S rRNA序列在分析B.cereus的種屬關(guān)系及群類上的分辨率不高，主要原因是在親緣關(guān)系較近的物種之間16S rRNA序列通常只有單個(gè)堿基或者少數(shù)幾個(gè)堿基的差異，造成進(jìn)化樹分支置信度較低。

Bootstrap值為1000，每個(gè)枝的前部分為該序列的GenBank基因號(hào)(Accession number)，后部分為該序列的來源菌株名稱或編號(hào)The boostrap confidence value was 1000，the front part of the branch was the accession number of the sequence，the rear part was the name of strain

圖3 cry基因種類鑒定結(jié)果

除16S rRNA序列外，gyrB基因序列也常用于細(xì)菌的遺傳多樣性分析[5-7]。gyrB基因是普遍存在于細(xì)菌內(nèi)編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因，具有比16S rRNA序列更高的變異率，而根據(jù)大腸桿菌(Escherichiacoli)、假單胞菌(Pseudomonasputida)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)DNA促旋酶(gyrases)的氨基酸保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物up1和up2r，被廣泛運(yùn)用于擴(kuò)增gyrB基因B亞基序列[17]。在進(jìn)行B.cereus的研究中，gyrB基因序列也被用于種屬關(guān)系分析及群類分析[19]。本研究結(jié)果表明，與16S rRNA序列的進(jìn)化樹相似，gyrB基因序列的進(jìn)化樹在BtI和B.cereusI兩個(gè)群得到了聚集，但是具有更高的置信度，由此可看出，進(jìn)行芽孢桿菌的群類分析時(shí)，gyrB基因序列比16SrRNA序列具有更高的分辨率；B.thuringiensisserkenyaeIEBC-T04B001、B.thuringiensisserthompsoniIEBC-T12和B.thuringiensisserhigoIEBC-T44 3個(gè)菌株均在16S rRNA和gyrB基因序列的2個(gè)進(jìn)化樹中聚集在BtI群的一簇中。此外，2個(gè)進(jìn)化樹都在B.cereusI這一簇中包含了B.thuringiensissertolworthiIEBC-T09菌株的序列；基于16S rRNA序列與gyrB基因序列的進(jìn)化樹在一定程度上具有一致性，與Punina[19]的報(bào)道一致。

本研究從gyrB基因序列的進(jìn)化樹中還發(fā)現(xiàn)GXZY032菌株分別聚集到兩個(gè)大的分支，并具有較高的置信值。在其中一個(gè)分支中，包含了BtⅡ和BtⅢ。其中，GXZY032菌株與BtⅡ群聚到了一個(gè)大簇中，且這個(gè)簇中的每個(gè)分支都具有較高的置信值，更進(jìn)一步證實(shí)GXZY032菌株屬于蘇云金芽孢桿菌的BtⅡ群，可為后期利用該菌株進(jìn)行基因組分析或更進(jìn)一步的應(yīng)用研究提供堅(jiān)實(shí)的分類基礎(chǔ)。

不同的δ-內(nèi)毒素類型對(duì)不同昆蟲的毒殺作用存在差異[20]，因此進(jìn)行cry基因類型的鑒定對(duì)于新發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌的研究具有重要指導(dǎo)意義。已有研究表明，cry1基因在蘇云金芽孢桿菌中出現(xiàn)的頻率最高[22]，而cry基因的種類數(shù)量眾多，本研究?jī)H檢測(cè)其中的8種類型。此外，不同來源的菌株可能會(huì)在基因序列上具有多態(tài)性，如果所擴(kuò)增的片段大小與預(yù)期大小存在差異，原因可能是引物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了變化，也有可能是包含有新的cry基因[20]。GXZY032菌株除了包含cry1，cry2和cry10基因外有可能還包含其他類型的cry基因，將來可通過基因組測(cè)序深入挖掘該菌株與內(nèi)毒素相關(guān)的基因信息。

4 結(jié) 論

經(jīng)基于16S rRNA和gyrB基因序列的多態(tài)性分析，明確了具有煙草甲幼蟲毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌菌株GXZY032屬于BtⅡ群；經(jīng)PCR驗(yàn)證，GXZY032菌株具有cry1、cry2和cry103種類型cry殺蟲基因。

致 謝：在本研究中，陳琦和鄒承武完成數(shù)據(jù)分析和論文初稿的寫作；孫建生、李季剛、鄒克興、蘇贊、梁偉和蔡聯(lián)合參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，特致謝意。