宋 宇,王 鵬,韋月平

(遼東學(xué)院, 遼寧 丹東 118003)

【研究意義】土壤微生物數(shù)量巨大，種類繁多，細(xì)菌是土壤中數(shù)量最為豐富、分布最為廣泛的微生物類群[1]。土壤細(xì)菌在有機(jī)物質(zhì)分解、養(yǎng)分運轉(zhuǎn)、土壤結(jié)構(gòu)維持和溫室氣體產(chǎn)生等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[2-3]。同時，土壤細(xì)菌的數(shù)量和結(jié)構(gòu)受土壤類型、土壤理化性質(zhì)、植被類型和農(nóng)田管理制度等多方面因素的影響[4-6]。由于世界人口的增長，糧食安全正成為一個全球性的問題。大米是大約30億人日常飲食中的主要成分。因此水稻生產(chǎn)是全球糧食安全的重要組成部分。過去幾十年中，由于大量使用化肥和農(nóng)藥，水稻產(chǎn)量有所增加，但化肥和農(nóng)藥的過量使用會導(dǎo)致土壤酸化板結(jié)、溫室氣體排放增加、水體富氧化等一系列生態(tài)環(huán)境問題[7-9]。如今，以當(dāng)?shù)睾涂稍偕Y源為基礎(chǔ)，將個別農(nóng)場的作物和動物生產(chǎn)有效結(jié)合起來以提高養(yǎng)分循環(huán)效率為目的的生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)則受到人們廣泛關(guān)注。相關(guān)研究描述了水稻-魚、稻-鴨、稻-龜和稻蛙種植生態(tài)系統(tǒng)并說明了這些做法如何降低化肥和農(nóng)藥施用量[10]，但對水稻種植模式的研究大多集中在病蟲害、土壤理化性質(zhì)的影響上[11-13]，而對不同栽培模式下稻田土壤細(xì)菌多樣性的研究則鮮見。【前人研究進(jìn)展】傳統(tǒng)的土壤微生物分離培養(yǎng)方法難以反映土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)、豐度及其作用機(jī)制[14],20世紀(jì)末，隨著PCR、DGGE、T-RFLP等分子生物技術(shù)的發(fā)展為研究環(huán)境樣品中微生物的群落多樣性和豐度成為可能，但檢測到的細(xì)菌群落豐度相對較低，范圍較小且操作復(fù)雜成本高[15]。高通量測序技術(shù)具有靈敏度高的優(yōu)點且低錯誤率、低成本可較快速準(zhǔn)確地獲取土壤微生物信息[16]因而被應(yīng)用于細(xì)菌群落多樣性分析中?！颈狙芯壳腥朦c】本研究使用高通量測序技術(shù)開展3種不同栽培模式下稻田表層土壤細(xì)菌多樣性研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討不同栽培模式稻田表層土壤細(xì)菌多樣性，不同分類水平的優(yōu)勢類群及各類群的相對豐度，細(xì)菌多樣性和土壤理化性質(zhì)的關(guān)系。為生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)提升稻田土壤質(zhì)量合理選擇水稻栽培模式提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗設(shè)計

試驗于2018年9月28日水稻結(jié)穗期在丹東東港市北井子鎮(zhèn)蓋家壩農(nóng)場進(jìn)行,供試稻田分別是河蟹共作稻田(SDHXZ)、非洲雁共作稻田(SDFYZ)和單作稻田(SDKBZ)，分別在3個模式稻田進(jìn)行5點取樣，采集0～5 cm的表層土壤充分混勻，每份土樣分成2份，1份去用于細(xì)菌多樣性分析，1份用于測土壤理化性質(zhì)。

1.2 測定方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)的測定 土壤pH值采用酸度計測定，氨氮和硝氮測定采用氯化鉀浸提-分光光度法，速效鉀測定采用氯化鈣浸提-火焰光度計法,速效磷測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法，有機(jī)質(zhì)測定采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法。

1.2.2 土壤細(xì)菌總DNA提取及高通量測序 樣品土壤細(xì)菌總DNA提取及高通量測序均在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。細(xì)菌多樣性鑒定區(qū)域：16SV3～V4區(qū)。通用引物為338F(5’-ACTCCTACGGGAGGGAGCA-3’)和806R(5’-GGACTCHVGGGTWTCTAAT-3’)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與生物信息統(tǒng)計方法

使用Trimmomatic和Flash軟件進(jìn)行原始雙端序列去雜和拼接。采用Usearch軟件進(jìn)行OTU分析并采用RDP classifier 貝葉斯算法對97 %相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。利用mothur軟件計算Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、shannon指數(shù)等。利用Qiime計算beta多樣性距離矩陣并利用R語言作圖。通過statistic10.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同栽培模式稻田土壤的理化性質(zhì)

由表1可以看出,3種栽培模式下稻田土壤的理化性質(zhì)差異較大，與水稻單作組比，河蟹共作稻田pH值下降而非洲雁共作稻田則上升。河蟹稻田和非洲雁稻田的氨氮，硝氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)含量都顯著提高，河蟹稻田的速效鉀值較單作稻田降低但非洲雁稻田則顯著提升。

2.2 土壤樣品測序

2.2.1 OTU及分類學(xué)分析 通過Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)測定9個土壤樣本細(xì)菌的16SrRNA V3～V4變異區(qū)序列，共獲得240 070個有效序列數(shù)，平均測序長度為420～460 bp。通過Usearch軟件結(jié)合RDP classifier 貝葉斯算法對97 %相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析后共獲得3157個OTU,分屬于48個門，115個綱，224個目，391個科，721個屬，1343個種。

表1 不同栽培模式的稻田土壤理化性質(zhì)

注:數(shù)據(jù)由平均值和標(biāo)準(zhǔn)差組成,不同的字母代表處理間存在顯著差異(P<0.05)相同的字母代表處理間不存在顯著差異(P>0.05)。

Notes:The data consists of averages and standard deviations, different letters mean that there are significant differences(P<0.05),while the same letters mean no significant differences(P>0.05).

2.2.2 物種Venn圖分析 Venn圖是利用R語言對相似水平為97 %的OTU進(jìn)行統(tǒng)計和作圖，可用于多個樣本中所共有和獨有的物種(如OTU)數(shù)目，可以比較直觀的表現(xiàn)環(huán)境樣本的物種(如OTU)組成相似性及重疊情況。從圖1可以看出，3種栽培模式稻田土壤細(xì)菌共有的OTU數(shù)為1525個，SDKBZ 和SDHXZ共有的OTU數(shù)最多為2183個，SDKBZ和SDFYZ共有的OTU數(shù)最少為1610個。不同的OTU代表不同的物種，SDFYZ特有的OTU數(shù)最多為357個，說明特有的物種數(shù)最多。

2.3 土壤細(xì)菌群落多樣性分析

2.3.1 α-多樣性分析 α多樣性是指某個群落或生境內(nèi)部的種的多樣性，常用的度量標(biāo)準(zhǔn)有Chao1、Shannon、Ace、Coverage等。Chao1指數(shù)用來估計群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)。Shannon指數(shù)可用來反映樣品的多樣性程度，其值越高說明群落物種的多樣性越高。Ace指數(shù)用來估算群落物種的豐富度，其值越高表明物種群落豐度越高。Coverage指數(shù)可用來反映測序的深度。從表2可以看出，3種栽培模式的測序覆蓋度都達(dá)到了99 %，說明各樣品的取樣都能達(dá)到一定深度，能反映各樣品土壤細(xì)菌群落的真實情況。由表2可以看出，SDHXZ的Chao1、Shannon和Ace 3種多樣性指數(shù)均高于SDKBZ和SDFYZ，說明有機(jī)稻田在引入河蟹后土壤細(xì)菌的多樣性和豐富度均有提升。而SDFYZ的3種多樣性指數(shù)卻低于SDKBZ和SDHXZ說明非洲雁糞肥的稻田土壤，雖然土壤肥力提升顯著但其細(xì)菌的多樣性和豐度并未得到提升。

圖1 不同栽培模式稻田土壤細(xì)菌Venn圖分析

2.3.2 土壤細(xì)菌多樣性與理化因子的相關(guān)性分析 從表3可以看出，Ace指數(shù)和pH及氨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)。Shannon指數(shù)和硝態(tài)氮呈正相關(guān)。Chao1和Ace指數(shù)均和6種理化因子呈負(fù)相關(guān)。

2.3.3 β多樣性分析 β多樣性表示的是微生物群落構(gòu)成的比較, 可評估微生物群落間的差異。從圖2可以看出，SDFYZ和SDHXZ之間及二者與SDKBZ之間的距離都較遠(yuǎn)，表明3種栽培模式稻田土壤細(xì)菌群落的OTU組成差異較大，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異也較大。

表2 不同栽培模式下稻田土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

表3 稻田土壤理化因子與細(xì)菌群落多樣性指數(shù)相關(guān)性分析

圖2 3種栽培模式稻田土壤細(xì)菌群落主成分(PCoA)分析圖

2.4 3種栽培模式稻田土壤細(xì)菌群落組成分析

2.4.1 細(xì)菌優(yōu)勢菌門分析 從圖3可知，3個樣本中含量最高的門是變形菌門(Proteobacteria)，平均豐度為35.51 %，其SDKBZ、SDHXZ和SEDFYZ的相對豐度依次為33.41 %±3.50 %、36.73 %±3.48 %、36.37 %±0.52 %；其次為擬桿菌門(Bacteroidetes)平均豐度為13.69 %，相對豐度依次為12.12 %±2.04 %、15.62 %±3.24 %、13.32 %±5.32 %；綠彎菌門(Chloroflexi)，平均豐度為13.66 %，相對豐度依次為12.22 %±2.32 %、13.64 %±2.48 %、15.12 %±2.63 %；放線菌門(Actinobacteria)，平均豐度為9.67 %，相對依次為8.23 %±1.32 %、6.87 %±1.16 %、13.92±7.28 %；酸桿菌門(Acidobacteria),平均豐度為7.90 %，相對豐度依次為10.31 %±1.05 %、6.88 %±2.37 %、6.52 %±1.34 %；藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)平均豐度為5.38 %，相對豐度依次為8.48 %±1.77 %、5.15 %±2.90 %、2.51 %±1.24 %。其余的硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)等相對豐度較低。說明在3種栽培模式下稻田土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)。

圖3 3種栽培模式稻田表層土壤優(yōu)勢菌門的微生物組成豐度圖

2.4.2 細(xì)菌優(yōu)勢菌屬分析 從圖4可知，平均豐度低于0.01 %的物種被合并為圖中的others，其在SDKBZ、SDHXZ和SDFYZ中分別占46.28 %、45.03 %和44.33 %。相對豐度>1 %的優(yōu)勢菌屬有18個。共有22個屬因在分類學(xué)數(shù)據(jù)庫分類學(xué)譜系的中間等級，沒有科學(xué)名稱，所以用norank作為標(biāo)記。主要優(yōu)勢菌屬為norank-厭氧繩菌屬其在SDKBZ、SDHXZ和SDFYZ中的平均豐度依次為4.49 %、4.24 %和7.00 %；norank-藍(lán)細(xì)菌屬其平均豐度依次為6.31 %、3.24 %和1.38 %；norank-擬桿菌屬-VadinHA17其平均豐度依次為1.85 %、4.74 %和2.63 %；norank-酸桿菌屬其平均豐度依次為3.23 %、1.93 %和3.85 %；norank-p-Saccharibacteria其平均豐度依次為2.68 %、3.10 %和1.83 %。

3 討 論

本研究利用Illumina Miseq平臺對16srDNA基因的V3～V4變異區(qū)進(jìn)行高通量測序分析，成功獲得3種栽培模式水稻表層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的全面菌群信息。共獲得有效序列數(shù)240070個，3157個OTUs.其中SDKBZ的OTUs數(shù)為2443個、SDHXZ為2540個、SDFYZ為2168個。Venn 圖表明3種栽培模式共有的細(xì)菌 OTU 數(shù)為1525個，SDFYZ特有的 OTU 數(shù)為357個，高于SDHXZ 56.3 %,SDKBZ 50.98 %。雖然SDFYZ的 OTU 數(shù)低于SDHXZ和SDKBZ，但特有的OTU 數(shù)卻明顯高于SDHXZ和SDKBZ說明僅依靠非洲雁糞肥的稻田土壤可獲得更多的細(xì)菌特有物種。

圖4 3種栽培模式下水稻表層土壤優(yōu)勢屬的微生物組成豐度圖

本研究通過土壤理化因子測定和α-多樣性分析表明，由于河蟹的排泄作用，改變了稻田的pH值并增加了氨態(tài)氮、硝態(tài)氮及速效磷和有機(jī)質(zhì)的含量，改善了稻田土壤細(xì)菌的生長條件同時河蟹通過爬行、打洞等活動有效地增強了土壤的透氣性，因此增加了河蟹稻田土壤細(xì)菌的多樣性和豐度。這和趙翔剛等[17-18]的研究結(jié)果一致。而SDFYZ通過非洲雁的排泄作用在沒有施加任何肥料的情況下雖然顯著提升了土壤各種養(yǎng)分含量但土壤細(xì)菌的多樣性和豐度并未得到提升，可能和非洲雁是站立行走而非爬行同時雁蹼平鈍而非銳利因此會增加土壤的緊密性而影響了土壤的透氣性有關(guān)。通過β多樣性分析表明3種稻田栽培模式的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)彼此差異都較大。

有研究表明土壤理化因子對土壤細(xì)菌群落有顯著的影響[19-20]，本文進(jìn)行了土壤細(xì)菌多樣性與理化因子的相關(guān)性分析，Ace指數(shù)和pH和氨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)。Shannon指數(shù)和硝態(tài)氮呈正相關(guān)。Chao1和Ace指數(shù)均和6種理化因子呈負(fù)相關(guān)。

通過樣品細(xì)菌群落組成分析表明3種栽培模式的土壤表層土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)。其中以變形菌門(Proteobacteria)為最大優(yōu)勢菌門，這和以前的一些研究結(jié)果一致[21-23]。相對豐度>1 %的優(yōu)勢菌屬有18個。

4 結(jié) 論

稻田中放入一定量的河蟹既增加了土壤的養(yǎng)分含量又提升了土壤細(xì)菌的多樣性，因此具有更好的微生物生態(tài)基礎(chǔ)。稻田中放入非洲雁，可增加土壤肥力但并未提升土壤細(xì)菌的多樣性，若采取一定措施增加土壤透氣性這能否進(jìn)一步提升土壤細(xì)菌的多樣性和豐度還有待于進(jìn)一步探討。該研究可為合理選擇和改進(jìn)水稻栽培模式提供一定理論支持。