趙凱琴，羅延青，俎 峰，王敬喬*，李勁峰，陳 葦，張?jiān)圃?，楊清輝

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南 昆明 650205)

【研究意義】油菜(BrassicanapusL.)是世界上食用植物油的主要來(lái)源之一。提高油菜單位面積產(chǎn)量或產(chǎn)油量一直是中國(guó)油菜育種重點(diǎn)研究課題。提高油菜品種含油量是提高油菜產(chǎn)油量的最有效方式[1]，是提高油菜生產(chǎn)效益的關(guān)鍵[2]和油菜育種的主要目標(biāo)[3]。通過(guò)GlgC基因在油菜胚發(fā)育前期、中后期表達(dá)，以期增加淀粉積累及油脂合成前體物質(zhì)(果糖)的含量，提高前期胚的生長(zhǎng)速度；同時(shí)為中、后期胚發(fā)育提供最直接的碳源，達(dá)到增加種子含油量的目的?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 AGPase(腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶)是淀粉合成途徑的關(guān)鍵限速酶，其催化淀粉合成前體腺苷二磷酸葡萄糖的產(chǎn)生。GlgC是同源四聚體，單基因編碼AGPase。AGPase在細(xì)菌和植物及糖原合成中起相似作用[4]。Stark等[5]的研究證明，來(lái)源于細(xì)菌的AGPase基因GlgC在馬鈴薯球莖中過(guò)表達(dá)可增加淀粉含量30 %。Sweetlove等[6]通過(guò)抑制馬鈴薯AGPase 的活性導(dǎo)致淀粉合成的部分或全部終止。Helence[7]等利用胚特異啟動(dòng)子降低了AGPase在轉(zhuǎn)基因油菜中的表達(dá)；通過(guò)同位素示蹤分析顯示，AGPase活性下降導(dǎo)致淀粉合成效率下降50 %～60 %，淀粉含量下降接近50 %～70 %；同時(shí)，通過(guò)對(duì)種子發(fā)育各個(gè)時(shí)期油含量的分析，AGPase活性下降導(dǎo)致了含油量的下降，特別是在胚發(fā)育中期以前，轉(zhuǎn)基因株系胚含油量比野生型下降50 %以上。目的基因的組織特異性及時(shí)空表達(dá)對(duì)最終產(chǎn)物的作用效果影響極大，如利用組成型的35S啟動(dòng)子和維管特異啟動(dòng)子4CL分別過(guò)表達(dá)蔗糖合酶基因SuSy，前者使楊樹(shù)莖干重下降，后者使莖干重上升[8]。因此，啟動(dòng)子的選擇能直接影響預(yù)期結(jié)果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】構(gòu)建了兩個(gè)含特異表達(dá)啟動(dòng)子的GlgC基因種子特異過(guò)表達(dá)載體，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】獲得甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)GlgC基因陽(yáng)性株，為利用遺傳改良技術(shù)實(shí)現(xiàn)上述途徑在油菜基因工程育種中的應(yīng)用提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受體 甘藍(lán)型油菜BrassicanapusL. ‘ westar’(加拿大引進(jìn))。

1.1.2 菌種 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)及根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) LB4404感受態(tài)均購(gòu)于Takara 大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 載體 克隆載體pMD18-T Vector 購(gòu)于Takara 大連寶生物工程有限公司；載體pMB-TG、pMB3-14、pMB-Fad2為本實(shí)驗(yàn)室保存及構(gòu)建。

1.1.4 分子試劑及化學(xué)試劑 所有酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker 購(gòu)于Takara 大連寶生物工程有限公司；化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥胚特異啟動(dòng)子DOF的克隆(At4g21080) 根據(jù)Genbank 中已公布的擬南芥早期胚特異啟動(dòng)子At4g21080(DOF4.5)的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以野生型擬南芥基因組DNA為模板，擴(kuò)增985 bp啟動(dòng)子片段。PCR程序: 94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，1 min，72 ℃，1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。將PCR產(chǎn)物連接到PMD18T上，載體命名為pMD18T-DOF。

1.2.2GlgC特異啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 擬南芥胚特異啟動(dòng)子DOF+ GlgC突變基因表達(dá)載體的構(gòu)建：①載體pMB-TG上有2個(gè)XbaI位點(diǎn)，為下一步的重組克隆要先消除3′端的XbaI位點(diǎn)。用XbaI部分酶切pMB-TG，klenow補(bǔ)平，自連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5自連挑菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行XbaI單酶切和XbaI+KpnI雙酶切鑒定，酶切結(jié)果應(yīng)為線性和-330 bp片段。將消除3′端的XbaI位點(diǎn)的pMB-TG命名為pMB-TG-XbaI。②連接頭：XbaI單酶切pMB-TG-XbaI，klenow補(bǔ)平，膠回收，去磷酸化，連接PXhoI,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5腸桿挑菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行XhoI+KpnI雙酶切鑒定(-330 bp)。將消除5′端XbaI并連上PXhoI的pMB-TG-XbaI命名為pMB-TG-XhoI。③用SmaI+SalI雙酶切pMD18T-DOF，電泳回收～1.0 kB的擬南芥早期胚特異啟動(dòng)子At4g21080(DOF4.5)片段插入到經(jīng)PmeI+XhoI雙酶切的pMB-TG-XhoI并去磷酸化的開(kāi)環(huán)載體上(SmaI和PmeI為平末端；SalI和XhoI為同鏈末端)，轉(zhuǎn)化后鑒定的陽(yáng)性正向克隆送測(cè)序。

種子特異蛋白啟動(dòng)子Cruc+GlgC突變基因表達(dá)載體的構(gòu)建:將實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含Cruc啟動(dòng)子的pMB3-14進(jìn)行SalI酶切，切下Cruc啟動(dòng)子片段，連接到經(jīng)過(guò)相同酶切，回收載體大片段的pMB-Fad2載體上，命名為pMB-Cruc。XbaI單酶切含～1.6 kBGlgC片段的pMD18T-TG，將目的片段連接到經(jīng)XbaI 酶切的pMB-Cruc上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，鑒定后的陽(yáng)性正向克隆送測(cè)序。

1.2.3GlgC基因表達(dá)載體的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化GlgC基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:將重組質(zhì)粒pMB-DOF-TG、pMB-Cruc-TG導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404(采用凍融法)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化油菜及抗Kan再生植株篩選:①將轉(zhuǎn)化受體‘Wester’種子用25 %次氯酸鈉滅菌，在MS培養(yǎng)基中25 ℃暗培養(yǎng)7 d;②挑取農(nóng)桿菌單克隆，置于相應(yīng)抗性的10 mL YEP液體培養(yǎng)基，27 ℃震蕩培養(yǎng)(200 r/min)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD 值0.3備用;③取上述已制備好的農(nóng)桿菌吸取0.5 mL加入20 mL MS培養(yǎng)基，將幼苗下胚軸切成0.5～1.0 cm 的小段浸入60 min，將下胚軸用濾紙吸干后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，25 ℃；④轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)14 d；其后在分化培養(yǎng)基中15 d繼代1次，至分化幼苗；再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)5～7 d繼代1次；待幼苗2～3 cm時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)(培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn)[9])。

1.2.4 轉(zhuǎn)化植株的分子生物學(xué)鑒定 PCR檢測(cè):PCR直接擴(kuò)增，以轉(zhuǎn)基因kan陽(yáng)性植株葉片為模板。引物為GlgC及NP TⅡ(表1)。PCR程序：98 ℃2 min；98 ℃10 s，60 ℃15 s，68 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)；68 ℃10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠水平電泳。

半定量RT-PCR檢測(cè)：取經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株葉片100 mg，提取總mRNA。按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書(shū)合成 cDNA。內(nèi)參基因?yàn)锽rasicanapusactin，擴(kuò)增引物為BnAc；目的片段AlgC擴(kuò)增引物為GlgCsq(表1)。PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠水平電泳。

表1 本文所涉及的引物序列

圖1 DOF克隆序列比對(duì)

1: M. DL5000 bp；2～5: pMD18T-DOF用EcoRI+SalI酶切1: M DL5000; 2-5: pMD18T-DOF digested by EcoRI+SalI

2 結(jié)果與分析

2.1 DOF啟動(dòng)子的克隆及序列分析

對(duì)pMD18T-DOF陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序，結(jié)果顯示成功獲得DOF基因的克隆(圖1)；對(duì)pMD18T-DOF質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI+SalI雙酶切，瓊脂糖電泳得到1025 bp條帶，成功獲得連有DOF啟動(dòng)子的pMD18T-DOF載體(圖2)。

2.2 特異啟動(dòng)子GlgC表達(dá)載體構(gòu)建

2.2.1 擬南芥胚特異啟動(dòng)子DOF(At4g21080)+GlgC突變基因表達(dá)載體的構(gòu)建 對(duì)轉(zhuǎn)化后鑒定的陽(yáng)性正向克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證目標(biāo)序列與pMB-TG-XhoI(去磷酸化)載體融合表達(dá)的讀碼框正確。結(jié)果顯示成功得到重組質(zhì)粒pMB-DOF-TG(構(gòu)建流程見(jiàn)圖3)。

2.2.2 種子特異蛋白啟動(dòng)子Cruc+GlgC突變基因表達(dá)載體的構(gòu)建 重組載體經(jīng)SacI+XbaI雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序比對(duì)，結(jié)果顯示成功構(gòu)建pMB-Cruc-TG載體(圖4)。

2.3 GlgC特異過(guò)表達(dá)載體在甘藍(lán)型油菜中的轉(zhuǎn)化

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將GlgC基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中，受體材料為油菜下胚軸，經(jīng)再生、分化及篩選，共獲得甘藍(lán)型油菜kan陽(yáng)性植株228 株。

2.4 轉(zhuǎn)化植株的分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 轉(zhuǎn)化植株的PCR鑒定 以kan陽(yáng)性株DNA為模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠水平電泳顯示獲得750 bp NPTII及1300 bpGlgC目標(biāo)條帶。228 株kan抗性轉(zhuǎn)化株中有202 株為PCR陽(yáng)性株(圖5～6)。

圖3 種子特異過(guò)表達(dá)載體pMB-DOF-TG構(gòu)建流程

2.4.2GlgC基因的RT-PCR表達(dá)與分析 結(jié)果顯示，外源導(dǎo)入的GlgC基因在PCR陽(yáng)性化株內(nèi)能夠表達(dá)。圖7為部分RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

3 討 論

在油菜種子中淀粉與油脂都在質(zhì)體中進(jìn)行合成，淀粉的降解可能為油脂的快速合成提供最近的碳源[10]。淀粉合成與環(huán)境條件、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)密切相關(guān)，淀粉在植物生長(zhǎng)速度較慢時(shí)(如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，低溫等條件下)積累[11]；低溫和長(zhǎng)日照均有利于淀粉的合成與積累[12]。同樣，對(duì)油菜和擬南芥的研究顯示環(huán)境條件對(duì)種子油含量也存在相當(dāng)大的影響[13]。欒運(yùn)芳等[14]的研究表明，在全國(guó)范圍內(nèi)，西藏種植的油菜含油量最高，與西藏地區(qū)晝夜溫差大、日照長(zhǎng)的環(huán)境條件密切相關(guān)。付三雄[15]在對(duì)南京(海拔8.9 m)和拉薩(海拔3652 m)2個(gè)不同海拔地區(qū)種植的甘藍(lán)型油菜高油品系H105的研究中發(fā)現(xiàn)，該材料含油量在兩地分別為46.04 %±1.42 %和53.09 %±1.35 %，顯示同一品種在西藏種植時(shí)含油量更高。這一結(jié)果間接表明了淀粉與油脂合成間存在正相關(guān)關(guān)系。

另外，目的基因的組織特異性及時(shí)空表達(dá)對(duì)最終產(chǎn)物的作用效果影響極大，在過(guò)表達(dá)研究中，啟動(dòng)子的選擇能直接影響預(yù)期結(jié)果。

圖4 種子特異過(guò)表達(dá)載體pMB-Cruc-TG構(gòu)建流程

1: DL15000(M)；2: 陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因植株)；3: 陽(yáng)性對(duì)照(pMB-DOF-TG)；4～25: 轉(zhuǎn)基因植株1: DL15000(M); 2: Negative control(non-transgenic plants); 3: Positive control(pMB-DOF-TG); 4-25: Transgenic plants

1：DL5000(M)；2：陽(yáng)性對(duì)照(pMB-Cruc-TG)；3：陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因植株)；4～25：轉(zhuǎn)基因植株1: DL5000(M)；2: positive control(pMB-Cruc-TG); 3: Negative control(non-transgenic plants); 4-25: Transgenic plants

1：陰性對(duì)照；2：陽(yáng)性對(duì)照；3～12：轉(zhuǎn)基因植株1: Transgenic lines; 2: Positive control; 3-12: Negative control

4 結(jié) 論

筆者在前期研究中克隆了淀粉合成途徑的關(guān)鍵酶AGPase的大腸桿菌同源基因GlgC并進(jìn)行了突變，獲得突變體GlgC16基因，降低對(duì)無(wú)機(jī)磷酸鹽敏感性，并進(jìn)行了質(zhì)體定位[8]。本研究在油菜AGPase小亞基導(dǎo)肽基因片段與上述GlgC突變基因構(gòu)建融合基因的基礎(chǔ)上，將GlgC突變基因分別和兩個(gè)特異表達(dá)啟動(dòng)子DOF(擬南芥早期胚(球形胚階段)啟動(dòng)子)、Cruc(油菜種子蛋白啟動(dòng)子)重組，構(gòu)建了2個(gè)GlgC過(guò)表達(dá)載體pMB-DOF-TG和pMB-Cruc-TG，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。通過(guò)油菜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并驗(yàn)證了外源導(dǎo)入的GlgC基因在陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因油菜植株內(nèi)獲得表達(dá)，獲得了甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)GlgC基因陽(yáng)性株，為利用遺傳改良技術(shù)實(shí)現(xiàn)上述途徑在油菜育種中的應(yīng)用奠定了前期基礎(chǔ)。期望通過(guò)GlgC基因的過(guò)表達(dá)，增加淀粉含量，為胚中油脂的快速合成提供最直接的碳源，達(dá)到增加含油量的目的。