魏 凱，鄭 偉，時(shí) 曉，何亞鵬，韓姝伊，董 穎，陳春山

(1.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京102100；2.吉林省延邊自治州水產(chǎn)站，吉林延吉 133001；3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京 100101；4.河北師范大學(xué)，石家莊 050024；5.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068)

馬蘇大麻哈魚(Oncorhynchusmasou)，隸屬于鮭科大麻哈魚屬，是僅分布在北太平洋亞洲一側(cè)水域的溯河洄游性魚類，主要分布在日本和我國(guó)的圖們江、綏芬河、臺(tái)灣的大甲溪中[1-2]。幼魚在淡水生活期間，分化成降海型和陸封型兩個(gè)生態(tài)群體，后者終生生活在淡水河流中，不營(yíng)降海洄游，但參與洄游群體的繁殖[3-5]。日本60年代將陸封型種群開發(fā)成人工養(yǎng)殖品種稱作山女鱒，被譽(yù)為20多種鮭科魚類中，肉質(zhì)最好、最受歡迎淡水游釣魚類，1996年引進(jìn)我國(guó)后進(jìn)行了詳細(xì)研究[6-10]。馬蘇大麻哈魚由于個(gè)體小，在原產(chǎn)地人工養(yǎng)殖2年一般體重250 g左右，而且具有鮭科魚類繁殖后親魚絕大部分死亡的特征，影響規(guī)模化生產(chǎn)的推廣。

魚類染色體組操作是水產(chǎn)領(lǐng)域運(yùn)用較為成熟的遺傳育種技術(shù)之一。三倍體魚類，理論上可以避免性腺發(fā)育階段和產(chǎn)卵季節(jié)魚肉質(zhì)量下降、生長(zhǎng)停滯和親魚死亡率上升等問題，并且具有個(gè)體大、生長(zhǎng)快和成活率高等優(yōu)良品質(zhì)[11-12]，已成為國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。鮭科魚類中的三倍體技術(shù)在虹鱒(O.mykiss)[13-14]、金鱒(O.mykissWalbaum)[15]、大西洋鮭(Salmosalar)[16]、美洲紅點(diǎn)鮭(Salvelinusfontinalis)[17-18]、細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)[19]等魚類中得到廣泛的研究應(yīng)用。但是，國(guó)內(nèi)外對(duì)于馬蘇大麻哈魚的三倍體研究仍處于空白狀態(tài)，本研究采用熱休克法進(jìn)行了三倍體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，對(duì)影響誘導(dǎo)率的水溫、受精時(shí)間和持續(xù)時(shí)間進(jìn)行探討，從而確定最佳的誘導(dǎo)條件。此外，考慮到部分鮭科魚類的三倍體雄性后代同樣出現(xiàn)性腺發(fā)育情況[13]，今后還將重點(diǎn)對(duì)馬蘇大麻哈魚三倍體的性腺發(fā)育和全雌三倍體制備技術(shù)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚和養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)用魚為吉林琿春細(xì)鱗魚良種場(chǎng)培育的2+齡陸封型馬蘇大麻哈魚(見圖1)，體質(zhì)量♀(654±182)g，♂(488±85)g。其中，雌性親魚524尾，共采卵60.84萬(wàn)粒，采卵水溫8.3 ℃，孵化期水溫6.4～10.8 ℃。親魚選擇、采卵受精、孵化方法按照陳春山等[9]方法進(jìn)行。馬蘇大麻哈魚的三倍體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和孵化工作在琿春細(xì)鱗魚良種場(chǎng)養(yǎng)殖車間進(jìn)行，后期將部分魚苗運(yùn)至北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心養(yǎng)殖基地進(jìn)行飼養(yǎng)管理。每個(gè)玻璃鋼水槽放置1 000尾魚苗，養(yǎng)殖用水為曝氣后的地下水，平均溶氧>8 mg/L，每天投喂6次，日投喂量按體重的5%～7%計(jì)算，每天上午9點(diǎn)和下午3點(diǎn)各吸污一次，養(yǎng)殖180 d后進(jìn)行倍性檢測(cè)。

圖1 陸封型馬蘇大麻哈魚Fig.1 Landlocked group of O.masou

1.2 三倍體誘導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)共分13個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組設(shè)4個(gè)誘導(dǎo)溫度(24、26、28、30 ℃)，2個(gè)起始誘導(dǎo)時(shí)間(15、20 min)，2個(gè)持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間(15、20 min)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)參數(shù)見表1。熱休克處理在不銹鋼水槽中進(jìn)行，電子控溫，水溫誤差<0.5 ℃，靈敏度0.1 ℃，熱處理前用CEM高精度數(shù)字溫度計(jì)(型號(hào)為DT-613)矯正水溫。熱處理后受精卵即刻放入裝有與采卵水溫相同水的容器中，靜置2 h挑除死卵。對(duì)照組受精后放入相同條件容器中，與熱處理卵同時(shí)挑除死卵。撿卵后放入相同孵化器中孵化。

表1 熱休克誘導(dǎo)馬蘇大麻哈魚三倍體實(shí)驗(yàn)參數(shù)Tab.1 Experiment parameters of heat shock induced triploid of O.masou

1.3 倍性檢測(cè)

采用Pacfec CyFIow Cube 8型流式細(xì)胞儀檢測(cè)魚苗血液DNA相對(duì)含量，取兩次平均值計(jì)算三倍體率。魚苗培育至體長(zhǎng)(8.24±0.74)cm，實(shí)驗(yàn)組每組隨機(jī)抽樣30尾，尾靜脈采血，每次取3尾二倍體魚苗作為對(duì)照，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在北京市水產(chǎn)研究所完成。綜合評(píng)分按照Gervai[20]標(biāo)準(zhǔn)，孵化率占60%，三倍體率占40%，計(jì)算綜合誘導(dǎo)效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用重量法計(jì)算采卵量。受精卵熱處理后2 h挑除死卵，統(tǒng)計(jì)死亡率。發(fā)眼后檢出未發(fā)眼卵，統(tǒng)計(jì)發(fā)眼率。出苗后檢出未孵化卵，統(tǒng)計(jì)孵化率。根據(jù)抽樣檢測(cè)結(jié)果計(jì)算三倍體率。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行整理，用SPSS19.0進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，分析各組間的差異性，其中P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

受精后15 min和20 min，熱休克處理15 min和20 min都可誘導(dǎo)出三倍體魚，但受精卵2 h死亡率、發(fā)眼率、孵化率、三倍體率差異顯著。起始處理時(shí)間15 min的6個(gè)組間及起始處理時(shí)間20 min的7個(gè)組間上述4項(xiàng)指標(biāo)差異較大。起始處理時(shí)間15 min和20 min之間無明顯規(guī)律。持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間15 min的6個(gè)組和20 min的7個(gè)組對(duì)上述4項(xiàng)指標(biāo)的影響與起始處理時(shí)間規(guī)律相同。說明在本實(shí)驗(yàn)條件下，起始處理時(shí)間和持續(xù)處理時(shí)間不是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主要因素。誘導(dǎo)結(jié)果如表2所示。

表2 馬蘇大麻哈魚三倍體誘導(dǎo)結(jié)果Tab.2 Experiment results of triploid induction by heat shock

注：同列中不同上標(biāo)字母表示各組間差異顯著(P<0.05)

在受精后15 min，用26 ℃和28 ℃處理，持續(xù)處理20 min組的2h死亡率低于15 min組，而孵化率和三倍體率高于15 ℃組。30 ℃處理組恰恰相反，持續(xù)處理20 min組的2 h死亡率高于15 min組，而孵化率和三倍體率則低于15 ℃組。在受精后20 min，用26、28 ℃和30 ℃處理，持續(xù)處理20 min組的2 h死亡率高于15 min組(第4組除外)，同時(shí)也高于起始時(shí)間15 min處理20 min組；而孵化率、三倍體率低于15 ℃組和起始15 min處理20 min組。說明隨著起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，受精卵成活率降低，特別是高溫組。起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間都不應(yīng)該超過20 min。

2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

受精卵經(jīng)24、26、28、30 ℃處理均獲得了三倍體魚(見表2)。各實(shí)驗(yàn)組2 h死亡率差異較大，都高于對(duì)照組。最高的是1組(24℃)8.01%，其次是4組(26℃)7.21%，其余各組在0.14%～2.96%之間。溫度對(duì)發(fā)眼率影響較小，除第6組和13組發(fā)眼率接近50%外，其它各組都在80%左右，與對(duì)照組(83.45%)接近，最高為93.84%(2組)。溫度對(duì)孵化率影響較大，實(shí)驗(yàn)組孵化率最高的是24 ℃組(68.35%)，最低的是30 ℃組(1.95%)。30 ℃組平均孵化率只有6.8%，26 ℃和28 ℃組孵化率也只有50%(34.02%～60.92%)左右，明顯低于對(duì)照組(86.62%)，說明熱休克處理對(duì)馬蘇大麻哈魚受精卵的成活影響較大。溫度對(duì)三倍體率的影響規(guī)律是：隨著溫度的升高，三倍體率逐漸升高，最低的是24 ℃組13.3%，最高的是30 ℃組90.91%。誘導(dǎo)溫度是影響馬蘇大麻哈魚三倍體誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵因素。

2.3 三倍體誘導(dǎo)率

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，馬蘇大麻哈魚二倍體DNA相對(duì)含量為33，三倍體DNA相對(duì)含量為51(見圖2)。經(jīng)抽樣檢測(cè),各實(shí)驗(yàn)組三倍體率有一定差異，最高的是12組(30 ℃)90.91%，最低的是1組(24 ℃)13.3%。平均三倍體率：24 ℃組13.3%，26 ℃組31.65%，28 ℃組52.28%，30 ℃組78.81%。

3 討論

3.1 誘導(dǎo)時(shí)間的確定

人工三倍體的誘導(dǎo)是通過保留受精卵第二極體來實(shí)現(xiàn)的。精子進(jìn)入卵子時(shí)，卵子正進(jìn)入減數(shù)分裂中期，數(shù)分鐘后即釋放出第二極體。通過物理或化學(xué)的方法抑制第二極體排放，受精卵中保留了兩套雌核的染色體和一套雄核的染色體而成為三倍體。因此，起始誘導(dǎo)時(shí)間非常重要，處理過早第二極體沒有形成，外界刺激容易對(duì)卵子造成傷害。處理過晚第二極體已經(jīng)釋放完成，不能形成三倍體胚胎。此外，不同魚類第二極體排放時(shí)間不同，溫水魚類較早，冷水魚類較遲，鮭科魚類一般在15-40 min。張燕萍等[14]認(rèn)為，虹鱒授精后15 min是熱休克敏感期，此時(shí)第二極體已形成但未排出細(xì)胞外，是獲得三倍體的最佳時(shí)期。本實(shí)驗(yàn)在溫度相同(26 ℃和28 ℃)的條件下，起始誘導(dǎo)時(shí)間15 min持續(xù)處理20 min的2 h死亡率、孵化率、三倍體率均高于起始誘導(dǎo)時(shí)間20 min持續(xù)處理20 min。說明馬蘇大麻哈魚受精后15 min已進(jìn)入減數(shù)分裂晚期，35 min后第二極體已釋放完畢，此時(shí)段是獲得三倍體的最佳時(shí)期。

圖2 二倍體和三倍體馬蘇大麻哈魚DNA相對(duì)含量Fig.2 Relative DNA content of diploid and triploid O.masou

樓允東[11]認(rèn)為，溫度休克誘導(dǎo)三倍體技術(shù)中，隨著持續(xù)時(shí)間的增加(在一定處理時(shí)間范圍內(nèi))，誘導(dǎo)率也在增加。本實(shí)驗(yàn)2個(gè)溫度組(26、28 ℃)受精后15 min進(jìn)行誘導(dǎo)處理，三倍體率持續(xù)誘導(dǎo)20 min組均高于持續(xù)誘導(dǎo)15 min組，30 ℃組沒有差異。說明在26～28 ℃處理?xiàng)l件下，受精后30-35 min仍有一部分受精卵處在第二極體排放階段，因此持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間應(yīng)達(dá)到20 min。

3.2 誘導(dǎo)溫度的確定

宋立民等[21-22]認(rèn)為，三倍體誘導(dǎo)需要適度的外界刺激，刺激太小不能有效阻止第二極體排放，刺激過大，胚胎受到傷害，存活率降低。張艷萍等[14]采用三個(gè)不同溫度(26.5、28、30 ℃)均可誘導(dǎo)出虹鱒三倍體，26.5 ℃效果最佳，30 ℃持續(xù)處理超過10 min受精卵全部死亡或停止發(fā)育。陳春山等[18]采用熱休克法誘導(dǎo)細(xì)鱗鮭三倍體，受精卵2～4 h死亡率和孵化率28 ℃明顯高于26 ℃。本實(shí)驗(yàn)處理溫度30 ℃組盡管三倍體率最高，但孵化率只有1.95%～12.46%，明顯低于其它各組，說明30 ℃是誘導(dǎo)的極限溫度。

3.3 最佳誘導(dǎo)條件

王炳謙等[13]采用熱休克法誘導(dǎo)全雌虹鱒三倍體，26 ℃效果好于24 ℃和28 ℃的，最佳條件為卵子受精后20 min，26 ℃處理20 min。張艷萍等[14]熱休克誘導(dǎo)虹鱒三倍體最佳條件是受精后15 min，26.5 ℃處理10 min。Peter等[16]認(rèn)為溪鱒受精卵受精10 min后，在11～12 ℃水中預(yù)處理后放入28 ℃水刺激10 min，獲得三倍體率達(dá)到98%以上。Duba等[18]美洲紅點(diǎn)鮭三倍體最佳誘導(dǎo)條件是：受精卵受精后15 min，用28 ℃水刺激10 min或20 min，獲得三倍體率分別為53%和56%。按照Gervai等[20]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)條件下，馬蘇大麻哈魚三倍體誘導(dǎo)的最佳條件是：水溫28 ℃，卵子受精后15 min持續(xù)處理20 min，評(píng)分結(jié)果為57.79%。最佳誘導(dǎo)溫度與虹鱒[13-14]、金鱒[15]、細(xì)鱗鮭[19]不同，與大西洋鮭[17]、美洲紅點(diǎn)鮭[18]相同。處理時(shí)間與其它鮭科魚類接近。魚類溫度休克敏感性的差異，不僅與物種遺傳背景有關(guān)，還與卵子質(zhì)量、親魚成熟度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)三倍體率較低，是否與部分親魚個(gè)體較小卵子成熟度差異有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。綜合評(píng)分結(jié)果如表3所示。

表3 綜合評(píng)分結(jié)果Tab.3 Comprehensive scoring results