劉承情，代梨梨，宋超峰，彭 亮，李曉莉，陶 玲，李 谷

(1.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223；2.上海海洋大學海洋科學學院，上海201306)

微生物驅動的氮循環(huán)在氮的生物地球化學循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，其中主要由氨氧化微生物參與的氨氧化過程是硝化作用過程中的第一步，也是限速步驟[1]，受到各界學者的廣泛關注。而21世紀以來，古菌氨單加氧酶α亞基(Ammonia monooxygenase α-subunit，amoA)基因的發(fā)現(xiàn)[2]和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea，AOA)NitrosopumilusmaritimusSCM1的分離培養(yǎng)[3]，使得對氨氧化微生物的研究從細菌域擴展到古菌域。Pester等[4]把AOA分為五類，分別是Nitrosopumiluscluster(group I.1a)，Nitrosotaleacluster(group I.1a-associated)，Nitrososphaeracluster(group I.1b)，Nitrososphaerasister cluster，和Nitrosocalduscluster(ThAOA)，其中Nitrososphaerasister cluster類群中還未有AOA被分離。

目前AOA在養(yǎng)殖環(huán)境中的研究還非常有限，且多集中于海水和循環(huán)水養(yǎng)殖。例如三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘中的研究表明水體中的AOA多屬于Nitrosopumiluscluster[5]；南美白對蝦養(yǎng)殖池塘沉積物中的研究則表明AOA群落結構比較單一，且大多屬于泉古菌門(Crenarchaeote)[6]；在淡水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行的研究表明AOA的多樣性和豐度都高于氨氧化細菌(AOB)，且認為AOA在其中起著主要作用[7]。池塘養(yǎng)殖作為我國最主要的淡水養(yǎng)殖方式，通過研究養(yǎng)殖池塘環(huán)境中的氨氧化微生物，特別是氨氧化古菌，對于養(yǎng)殖過程中因配合飼料的大量使用而導致的有害氮素的去除具有重要意義，且能夠豐富當前氨氧化微生物的研究內容。因此在本研究中，我們以我國重要的淡水養(yǎng)殖區(qū)-湖北荊州地區(qū)的風生水起生態(tài)農(nóng)場的主養(yǎng)草魚池塘為研究對象，通過amoA基因研究了淡水養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中氨氧化古菌的多樣性和種群分布，以期為淡水養(yǎng)殖池塘的氮素調控提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

風生水起生態(tài)農(nóng)場位于湖北省荊州市荊州區(qū)，養(yǎng)殖水域由長江故道改造而來，長1 200 m，寬90 m，總面積為108 000 m2，平均水深為4～5 m，底泥深度約為1 m，故道的兩端已通過筑壩與外界水體隔離開來。池塘中主養(yǎng)草魚，套養(yǎng)花白鰱和團頭魴。在該養(yǎng)殖池塘中通過圍隔分為3個養(yǎng)殖區(qū)域(分別標記為F1、F2、F3)。養(yǎng)殖早期(2017年5月25日)在每個養(yǎng)殖區(qū)域設置3個采樣點(呈等邊三角)，使用彼得遜采泥器采集沉積物，均勻混合后裝入滅菌的封口聚乙烯袋，使用有機玻璃采水器采集水樣，混勻后裝入500 mL聚乙烯瓶中。樣品采集完成后立即低溫運回實驗室，水樣用濾膜過濾儲存于-20 ℃，沉積物樣品分裝后部分風干并過篩，儲存于4 ℃或-20 ℃以用于后續(xù)分析。采樣區(qū)域沉積物和水體理化指標見表1。

表1 沉積物和水體的理化性質Tab.1 Physical and chemical properties of sediment and water

1.1.2 主要試劑和儀器

E.Z.N.A.TMWater DNA Kit試劑盒(Omega)，DNeasy?PowerSoil?Kit試劑盒(QIAGEN)、2×Utaq MasterMix(莊盟生物)、10×DreamTaq buffer、DreamTaq DNA Polymerase、2mM dNTP Mix(均購自Thermo)、PCR儀(LifeECO)、凝膠成像儀(BIO-RAD)、電泳儀(DYY-6C型)。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

采用E.Z.N.A.TMWater DNA Kit試劑盒提取養(yǎng)殖水體中的DNA，采用DNeasy?PowerSoil?Kit試劑盒提取養(yǎng)殖池塘沉積物中DNA，提取方法基于試劑盒說明方法，考慮到沉積物沉積物的含水率以及所提DNA的濃度，實際操作是加入0.6～1.1 g新鮮土壤，其余按說明書進行DNA的提取。

1.2.2amoA基因擴增

通過PCR擴增AOAamoA基因，所用的引物為Arch-amoAF/Arch-amoAR，其序列分別是5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′、5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′，沉積物擴增的體系為25 μL(2.5 μL 10×DreamTaq buffer、10 μmol/L引物各1.5 μL、2 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL和樣品DNA 1 μL，補ddH2O至25 μL)，擴增的條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。水體擴增的體系25 μL(包括2×Utaq MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L引物各1.5 μL和樣品DNA 1 μL，補ddH2O至25 μL)，擴增的條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 70 s，32個循環(huán)；80 ℃ 20 s。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化和克隆測序

使用SK8131膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，純化后PCR產(chǎn)物通過連接試劑盒連接到pUCm-T Vector，將連接好的載體轉化入高效大腸桿菌感受態(tài)細胞。在涂有X-gal和IPTG的氨芐青霉素的LB平板上進行藍白斑篩選，隨機挑取克隆子至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。使用SK8191 UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒提取質粒，并測序(交由上海生工生物工程股份有限公司完成)。

1.2.4 克隆測序數(shù)據(jù)分析

用公式C=1-n/N

其中C為覆蓋率，即coverage，n為文庫中只出現(xiàn)1次的克隆數(shù)量，N為該文庫克隆總數(shù)用于計算文庫的覆蓋率。用Mothur 軟件分析克隆文庫的稀釋性曲線；并分析計算各文庫AOAamoA基因多樣性參數(shù)和Shannon指數(shù)。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

利用Mothur軟件分析克隆序列，并在3%差異度水平上定義為分類操作單元(即Operational taxonomic unit，簡稱為OTU)。并結合NCBI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST分析找到相似度最高的同源序列作為參照序列。將代表性OTU序列與相似序列一起用于系統(tǒng)進化樹分析。使用MEGA 7.0.26，以鄰接法(Neighbor-Joining)迭代運算1 000次構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果

2.1 AOA amoA基因的稀釋性曲線和物種多樣性

各采樣點AOAamoA基因克隆文庫的稀釋性曲線如圖1所示。通過計算發(fā)現(xiàn)各點的amoA基因在克隆文庫中相對應的覆蓋率均在88%以上(表2)，并且可以看出各點的曲線在后期均趨向平坦，說明本研究中克隆取樣的數(shù)量合理，能夠比較好的反映環(huán)境中的多樣性。

圖1 AOA amoA基因克隆文庫稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for AOA amoA gene clonesS-表示沉積物樣品，W-表示水體樣品，F(xiàn)1、F2、F3為3個采樣點

基于序列相似性大于97%計算的AOA OTU數(shù)目和多樣性指數(shù)見表2?？梢钥闯觯現(xiàn)1沉積物中AOA OTU的數(shù)目要少于F2和F3，但其水體中的OTU數(shù)目卻要高于后兩者。F1沉積物中的AOA多樣性指數(shù)也要低于F2和F3，但其水體中的多樣性指數(shù)要高于后兩者。說明沉積物和水體中AOA的分布存在差異，并非表現(xiàn)出均一性，即并非沉積物中AOA OTU數(shù)目多，其對應水體中OTU數(shù)目就多。通過對三個樣點總體的比較則發(fā)現(xiàn)，沉積物AOA的多樣性要高于水體中(OTU數(shù)目均值分別為10.33和7.33)，并且沉積物中AOA的多樣性也要高于水體中(Shannon指數(shù)均值分別為1.57和1.38，Simpson指數(shù)均值分別為0.28和0.33)。

2.2 AOA amoA基因的分布

基于Mothur對沉積物和水體中各點的AOAamoA基因文庫進行聚類分析，結果見圖2，從圖中可以看出，沉積物和水體樣品分別聚為兩支，且不論是在沉積物還是在水體中，F(xiàn)2和F3中的AOA都更為相似，這也與OTU數(shù)目和多樣性的結果一致。

表2 AOA amoA基因克隆文庫多樣性Tab.2 AOA diversity index in amoA gene clone library

基于3%的序列差異度分析發(fā)現(xiàn)，沉積物和水體中共檢測到24個OTU，其中沉積物中有18個OTU，水體中有13個OTU。沉積物和水體中共有的OTU包括OTU01、OTU02、OTU05、OTU07、OTU11、OTU13、OTU16，而OTU03、OTU04、OTU18、OTU19、OTU20、OTU21僅存在于水體中，其他序列OTU06、OTU08、OTU09、OTU10、OTU12、OTU14、OTU15、OTU17、OTU22、OTU23、OTU24僅存在于沉積物中，并且OTU01、OTU02在所有樣點的沉積物和水體中均有檢測到，這說明OTU01、OTU02是養(yǎng)殖池塘中的優(yōu)勢類群，分別占克隆子的47.38%和21.84%。

圖2 沉積物和水體中AOA amoA 基因文庫聚類分析圖Fig.2 Clustering diagram analysis of the different AOA amoA gene clone libraries in sediment and water

進一步通過venn圖分別比較了各樣點沉積物和水體中AOAamoA基因文庫中OTU的分布情況，見圖3。在沉積物中(圖3左)，F(xiàn)1獨有的OTU是OTU13、OTU14、OTU16，F(xiàn)2獨有的OTU是OTU17、OTU22，F(xiàn)3獨有的OTU是OTU11、OTU15、OTU23、OTU24；而F1和F2所共有的OTU有6個，分布是OTU01、OTU02、OTU05、OTU08，OTU10和OTU12，F(xiàn)1和F3所共有的OTU僅有4個，分別是OTU01、OTU02、OTU05、OTU08；F2和F3所共有的7個OTU分別是OTU01、OTU02、OTU05、OTU06、OTU7、OTU08、OTU09。在水體中(圖3右)，三個樣點中F1所獨有的5個OTU是：OTU05、OTU07、OTU13、OTU18、OTU20；OTU16是F2所獨有的OTU；OTU19、OTU21是F3所獨有的OTU。而F1和F2、F2和F3共有的OTU都有4個，F(xiàn)1、F2、F3共有的OTU也是4個，分別是OTU01、OTU02、OTU03和OTU04，此外F1和F3還共有一個OTU是OTU11。

圖3 沉積物和水體中AOA amoA 基因文庫OTU分布韋恩圖Fig.3 Venn diagram of the different AOA amoA gene clone libraries in sediment and water左：沉積物；右：水體。圖中數(shù)字表示OTU數(shù)目。

2.3 AOA amoA 基因系統(tǒng)發(fā)育分布

以鄰接法(Neighbor-Joining)對沉積物和水體中的AOAamoA基因的OTU序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。在圖中可見，AOAamoA基因的OTU序列主要屬于Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster，而未檢測到Nitrosocaldus cluster 和Nitrosotalea cluster。其中隸屬Nitrososphaerasister group的OTU有：OTU01、OTU02、OTU03、OTU04、OTU05、OTU08、OTU09、OTU10、OTU11、OTU13、OTU16、OTU17、OTU18、OTU19、OTU21、OTU24；隸屬Nitrososphaeracluster的OTU有：OTU12、OTU14、OTU15、OTU20；隸屬Nitrosopumiluscluster的OTU有：OTU06、OTU07、OTU22、OTU23。

與沉積物和水體中AOAamoA基因的分布的比較發(fā)現(xiàn)，沉積物和水體的共有序列除OTU07外，均屬于Nitrososphaerasister group。水體中除OTU07和OTU20外，均屬于Nitrososphaerasister group。而沉積物中則包含檢測到的Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster中的大多數(shù)種類。各樣點沉積物和水體中AOA系統(tǒng)類群的組成情況見圖5，可以發(fā)現(xiàn)各樣點間的AOA組成存在一定差異，但從總體上來看，水體中的AOA比較單一，幾乎都為Nitrososphaerasister類群，而沉積物中Nitrososphaerasister類群雖然也占據(jù)絕對優(yōu)勢，但也包含相對較多的其他類群。

3 討論

已有研究表明AOA相比AOB更適合厭氧環(huán)境[8]，且在水體[9]和土壤[10]等環(huán)境中AOAamoA基因的豐度和多樣性都更為豐富。近年來已有相關研究證實了在養(yǎng)殖池塘中存在AOA，其中多數(shù)研究都能在沉積物中檢測到AOAamoA基因，而部分研究則未能在水體中檢測到AOA，這可能是受到光抑制的影響。在本研究中，我們基于amoA基因的克隆文庫技術，對主養(yǎng)草魚池塘中的AOA進行了分析，發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖池塘的沉積物和水體中均存在AOA，但二者中的分布存在著差異。

在早期的研究中，已發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)殖過程的推進，池塘水體中的氨氧化微生物數(shù)量會下降，甚至難以檢測到氨氧化古菌[11]。在本研究中，通過對養(yǎng)殖前期的分析發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖水體中均檢測到AOA的存在，說明養(yǎng)殖過程可能會對池塘水體中的氨氧化古菌造成不利的影響。另外，對不同養(yǎng)殖區(qū)域沉積物和水體的比較發(fā)現(xiàn)，池塘沉積物中的AOA無論是種類數(shù)還是多樣性都要高于水體，而且高于在其他環(huán)境中檢測到的AOA OTU數(shù)目[12]，說明養(yǎng)殖池塘沉積物中可能存在更為豐富的AOA種類。在養(yǎng)殖池塘的區(qū)域分布上，我們對不同樣點的比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1沉積物中的AOA種類數(shù)和多樣性都要低于F2和F3，但F1水體中的種類數(shù)和多樣性要高于F2和F3，說明養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中的AOA存在著差異，AOA在二者中可能分別具有相對獨立的生態(tài)位。目前還沒有比較養(yǎng)殖環(huán)境中AOA在沉積物和水體中的分布規(guī)律，這可能有待進一步研究。我們對沉積物和水體中OTU的進一步分析發(fā)現(xiàn)，沉積物和水體中除存在少量的共有OTU外，還分別具有各自獨立存在的OTU，但檢測到的OTU共有序列數(shù)量在總體上占據(jù)絕大優(yōu)勢，說明養(yǎng)殖環(huán)境中具有廣分布生態(tài)位的種類可能更具優(yōu)勢，但這還需要進一步的研究。

圖4 基于amoA基因構建的養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中氨氧化古菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic analysis of archaeal amoA gene sequences retrieved from the aquaculture ponds of sediment and water

圖5 沉積物和水體中AOA系統(tǒng)類群的組成圖Fig.5 Composition of AOA species in sediment and water

從系統(tǒng)發(fā)育分析結果來看，養(yǎng)殖池塘系統(tǒng)中的AOAamoA基因序列與來自土壤、沉積物、水體及部分污水處理系統(tǒng)的基因序列高度相似。本研究測得的AOA包括Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster類群。先前有研究表明在養(yǎng)殖池塘表層沉積物中的AOA主要屬于Nitrososphaera類群，而在較深層的沉積物中的AOA主要屬于Nitrosopumilus類群[11]，另外針對養(yǎng)殖池塘水體中的研究也證明AOA絕大多數(shù)屬于Nitrosopumilus類群[5]。這與本研究中的結果存在著一定的差異，本研究中測得的74%的OTU序列都屬于Nitrososphaerasister group，水體和沉積物共有的OTU除OTU07屬于Nitrosopumiluscluster外，其它序列均屬于Nitrososphaerasister類群；而沉積物中除包含少量的Nitrososphaera類群外，主要的OTU仍然為Nitrososphaerasister類群，這說明Nitrososphaerasister類群可能是該主養(yǎng)草魚池塘中最重要的氨氧化功能類群。Nitrososphaerasister類群由Pester等[4]首次提出，與Nitrososphaera類群有共同的祖先，但與AOA其他類群分離開來。雖然目前已發(fā)現(xiàn)Nitrososphaerasister類群在陸地環(huán)境中分布廣泛且數(shù)量豐富[12]，但關于該類群的了解還很少，甚至還存在一定的爭議。例如，有證據(jù)表明amoA相關的Thaumarchaeota為異養(yǎng)型或兼養(yǎng)型，因為它們在加入有機物質時生長會加快[13]。而在其他的研究中，卻發(fā)現(xiàn)該類群的富集物能夠在自養(yǎng)條件下生長[14]。另外在湖泊沉積物中也發(fā)現(xiàn)Nitrososphaerasister類群Thaumarchaeota能夠固定二氧化碳[15]。雖然在本研究中草魚池塘沉積物和水體中的高有機質和氨氮水平可能有利于Nitrososphaerasister類群的發(fā)展，但其群落動態(tài)和影響因素還有待進一步研究。

4 結論

綜上所述，在主養(yǎng)草魚養(yǎng)殖池塘的水體和沉積物中均存在較為豐富的AOA，且在水體和沉積物中的分布存在差異。AOA在養(yǎng)殖池塘不同區(qū)域中的分布也存在差異。AOA主要屬于Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster，但Nitrososphaerasister group是優(yōu)勢種群，占了AOA種群的絕大部分。