劉承情，代梨梨，宋超峰，彭 亮，李曉莉，陶 玲，李 谷

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢430223；2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海201306)

微生物驅(qū)動(dòng)的氮循環(huán)在氮的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，其中主要由氨氧化微生物參與的氨氧化過(guò)程是硝化作用過(guò)程中的第一步，也是限速步驟[1]，受到各界學(xué)者的廣泛關(guān)注。而21世紀(jì)以來(lái)，古菌氨單加氧酶α亞基(Ammonia monooxygenase α-subunit，amoA)基因的發(fā)現(xiàn)[2]和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea，AOA)NitrosopumilusmaritimusSCM1的分離培養(yǎng)[3]，使得對(duì)氨氧化微生物的研究從細(xì)菌域擴(kuò)展到古菌域。Pester等[4]把AOA分為五類，分別是Nitrosopumiluscluster(group I.1a)，Nitrosotaleacluster(group I.1a-associated)，Nitrososphaeracluster(group I.1b)，Nitrososphaerasister cluster，和Nitrosocalduscluster(ThAOA)，其中Nitrososphaerasister cluster類群中還未有AOA被分離。

目前AOA在養(yǎng)殖環(huán)境中的研究還非常有限，且多集中于海水和循環(huán)水養(yǎng)殖。例如三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘中的研究表明水體中的AOA多屬于Nitrosopumiluscluster[5]；南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘沉積物中的研究則表明AOA群落結(jié)構(gòu)比較單一，且大多屬于泉古菌門(Crenarchaeote)[6]；在淡水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行的研究表明AOA的多樣性和豐度都高于氨氧化細(xì)菌(AOB)，且認(rèn)為AOA在其中起著主要作用[7]。池塘養(yǎng)殖作為我國(guó)最主要的淡水養(yǎng)殖方式，通過(guò)研究養(yǎng)殖池塘環(huán)境中的氨氧化微生物，特別是氨氧化古菌，對(duì)于養(yǎng)殖過(guò)程中因配合飼料的大量使用而導(dǎo)致的有害氮素的去除具有重要意義，且能夠豐富當(dāng)前氨氧化微生物的研究?jī)?nèi)容。因此在本研究中，我們以我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖區(qū)-湖北荊州地區(qū)的風(fēng)生水起生態(tài)農(nóng)場(chǎng)的主養(yǎng)草魚池塘為研究對(duì)象，通過(guò)amoA基因研究了淡水養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中氨氧化古菌的多樣性和種群分布，以期為淡水養(yǎng)殖池塘的氮素調(diào)控提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

風(fēng)生水起生態(tài)農(nóng)場(chǎng)位于湖北省荊州市荊州區(qū)，養(yǎng)殖水域由長(zhǎng)江故道改造而來(lái)，長(zhǎng)1 200 m，寬90 m，總面積為108 000 m2，平均水深為4～5 m，底泥深度約為1 m，故道的兩端已通過(guò)筑壩與外界水體隔離開(kāi)來(lái)。池塘中主養(yǎng)草魚，套養(yǎng)花白鰱和團(tuán)頭魴。在該養(yǎng)殖池塘中通過(guò)圍隔分為3個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域(分別標(biāo)記為F1、F2、F3)。養(yǎng)殖早期(2017年5月25日)在每個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)(呈等邊三角)，使用彼得遜采泥器采集沉積物，均勻混合后裝入滅菌的封口聚乙烯袋，使用有機(jī)玻璃采水器采集水樣，混勻后裝入500 mL聚乙烯瓶中。樣品采集完成后立即低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，水樣用濾膜過(guò)濾儲(chǔ)存于-20 ℃，沉積物樣品分裝后部分風(fēng)干并過(guò)篩，儲(chǔ)存于4 ℃或-20 ℃以用于后續(xù)分析。采樣區(qū)域沉積物和水體理化指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 沉積物和水體的理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of sediment and water

1.1.2 主要試劑和儀器

E.Z.N.A.TMWater DNA Kit試劑盒(Omega)，DNeasy?PowerSoil?Kit試劑盒(QIAGEN)、2×Utaq MasterMix(莊盟生物)、10×DreamTaq buffer、DreamTaq DNA Polymerase、2mM dNTP Mix(均購(gòu)自Thermo)、PCR儀(LifeECO)、凝膠成像儀(BIO-RAD)、電泳儀(DYY-6C型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

采用E.Z.N.A.TMWater DNA Kit試劑盒提取養(yǎng)殖水體中的DNA，采用DNeasy?PowerSoil?Kit試劑盒提取養(yǎng)殖池塘沉積物中DNA，提取方法基于試劑盒說(shuō)明方法，考慮到沉積物沉積物的含水率以及所提DNA的濃度，實(shí)際操作是加入0.6～1.1 g新鮮土壤，其余按說(shuō)明書進(jìn)行DNA的提取。

1.2.2amoA基因擴(kuò)增

通過(guò)PCR擴(kuò)增AOAamoA基因，所用的引物為Arch-amoAF/Arch-amoAR，其序列分別是5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′、5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′，沉積物擴(kuò)增的體系為25 μL(2.5 μL 10×DreamTaq buffer、10 μmol/L引物各1.5 μL、2 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL和樣品DNA 1 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL)，擴(kuò)增的條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。水體擴(kuò)增的體系25 μL(包括2×Utaq MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L引物各1.5 μL和樣品DNA 1 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL)，擴(kuò)增的條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 70 s，32個(gè)循環(huán)；80 ℃ 20 s。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化和克隆測(cè)序

使用SK8131膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，純化后PCR產(chǎn)物通過(guò)連接試劑盒連接到pUCm-T Vector，將連接好的載體轉(zhuǎn)化入高效大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在涂有X-gal和IPTG的氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取克隆子至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。使用SK8191 UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，并測(cè)序(交由上海生工生物工程股份有限公司完成)。

1.2.4 克隆測(cè)序數(shù)據(jù)分析

用公式C=1-n/N

其中C為覆蓋率，即coverage，n為文庫(kù)中只出現(xiàn)1次的克隆數(shù)量，N為該文庫(kù)克隆總數(shù)用于計(jì)算文庫(kù)的覆蓋率。用Mothur 軟件分析克隆文庫(kù)的稀釋性曲線；并分析計(jì)算各文庫(kù)AOAamoA基因多樣性參數(shù)和Shannon指數(shù)。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

利用Mothur軟件分析克隆序列，并在3%差異度水平上定義為分類操作單元(即Operational taxonomic unit，簡(jiǎn)稱為OTU)。并結(jié)合NCBI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST分析找到相似度最高的同源序列作為參照序列。將代表性O(shè)TU序列與相似序列一起用于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。使用MEGA 7.0.26，以鄰接法(Neighbor-Joining)迭代運(yùn)算1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 AOA amoA基因的稀釋性曲線和物種多樣性

各采樣點(diǎn)AOAamoA基因克隆文庫(kù)的稀釋性曲線如圖1所示。通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)各點(diǎn)的amoA基因在克隆文庫(kù)中相對(duì)應(yīng)的覆蓋率均在88%以上(表2)，并且可以看出各點(diǎn)的曲線在后期均趨向平坦，說(shuō)明本研究中克隆取樣的數(shù)量合理，能夠比較好的反映環(huán)境中的多樣性。

圖1 AOA amoA基因克隆文庫(kù)稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for AOA amoA gene clonesS-表示沉積物樣品，W-表示水體樣品，F(xiàn)1、F2、F3為3個(gè)采樣點(diǎn)

基于序列相似性大于97%計(jì)算的AOA OTU數(shù)目和多樣性指數(shù)見(jiàn)表2?？梢钥闯?，F(xiàn)1沉積物中AOA OTU的數(shù)目要少于F2和F3，但其水體中的OTU數(shù)目卻要高于后兩者。F1沉積物中的AOA多樣性指數(shù)也要低于F2和F3，但其水體中的多樣性指數(shù)要高于后兩者。說(shuō)明沉積物和水體中AOA的分布存在差異，并非表現(xiàn)出均一性，即并非沉積物中AOA OTU數(shù)目多，其對(duì)應(yīng)水體中OTU數(shù)目就多。通過(guò)對(duì)三個(gè)樣點(diǎn)總體的比較則發(fā)現(xiàn)，沉積物AOA的多樣性要高于水體中(OTU數(shù)目均值分別為10.33和7.33)，并且沉積物中AOA的多樣性也要高于水體中(Shannon指數(shù)均值分別為1.57和1.38，Simpson指數(shù)均值分別為0.28和0.33)。

2.2 AOA amoA基因的分布

基于Mothur對(duì)沉積物和水體中各點(diǎn)的AOAamoA基因文庫(kù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖2，從圖中可以看出，沉積物和水體樣品分別聚為兩支，且不論是在沉積物還是在水體中，F(xiàn)2和F3中的AOA都更為相似，這也與OTU數(shù)目和多樣性的結(jié)果一致。

表2 AOA amoA基因克隆文庫(kù)多樣性Tab.2 AOA diversity index in amoA gene clone library

基于3%的序列差異度分析發(fā)現(xiàn)，沉積物和水體中共檢測(cè)到24個(gè)OTU，其中沉積物中有18個(gè)OTU，水體中有13個(gè)OTU。沉積物和水體中共有的OTU包括OTU01、OTU02、OTU05、OTU07、OTU11、OTU13、OTU16，而OTU03、OTU04、OTU18、OTU19、OTU20、OTU21僅存在于水體中，其他序列OTU06、OTU08、OTU09、OTU10、OTU12、OTU14、OTU15、OTU17、OTU22、OTU23、OTU24僅存在于沉積物中，并且OTU01、OTU02在所有樣點(diǎn)的沉積物和水體中均有檢測(cè)到，這說(shuō)明OTU01、OTU02是養(yǎng)殖池塘中的優(yōu)勢(shì)類群，分別占克隆子的47.38%和21.84%。

圖2 沉積物和水體中AOA amoA 基因文庫(kù)聚類分析圖Fig.2 Clustering diagram analysis of the different AOA amoA gene clone libraries in sediment and water

進(jìn)一步通過(guò)venn圖分別比較了各樣點(diǎn)沉積物和水體中AOAamoA基因文庫(kù)中OTU的分布情況，見(jiàn)圖3。在沉積物中(圖3左)，F(xiàn)1獨(dú)有的OTU是OTU13、OTU14、OTU16，F(xiàn)2獨(dú)有的OTU是OTU17、OTU22，F(xiàn)3獨(dú)有的OTU是OTU11、OTU15、OTU23、OTU24；而F1和F2所共有的OTU有6個(gè)，分布是OTU01、OTU02、OTU05、OTU08，OTU10和OTU12，F(xiàn)1和F3所共有的OTU僅有4個(gè)，分別是OTU01、OTU02、OTU05、OTU08；F2和F3所共有的7個(gè)OTU分別是OTU01、OTU02、OTU05、OTU06、OTU7、OTU08、OTU09。在水體中(圖3右)，三個(gè)樣點(diǎn)中F1所獨(dú)有的5個(gè)OTU是：OTU05、OTU07、OTU13、OTU18、OTU20；OTU16是F2所獨(dú)有的OTU；OTU19、OTU21是F3所獨(dú)有的OTU。而F1和F2、F2和F3共有的OTU都有4個(gè)，F(xiàn)1、F2、F3共有的OTU也是4個(gè)，分別是OTU01、OTU02、OTU03和OTU04，此外F1和F3還共有一個(gè)OTU是OTU11。

圖3 沉積物和水體中AOA amoA 基因文庫(kù)OTU分布韋恩圖Fig.3 Venn diagram of the different AOA amoA gene clone libraries in sediment and water左：沉積物；右：水體。圖中數(shù)字表示OTU數(shù)目。

2.3 AOA amoA 基因系統(tǒng)發(fā)育分布

以鄰接法(Neighbor-Joining)對(duì)沉積物和水體中的AOAamoA基因的OTU序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖4。在圖中可見(jiàn)，AOAamoA基因的OTU序列主要屬于Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster，而未檢測(cè)到Nitrosocaldus cluster 和Nitrosotalea cluster。其中隸屬Nitrososphaerasister group的OTU有：OTU01、OTU02、OTU03、OTU04、OTU05、OTU08、OTU09、OTU10、OTU11、OTU13、OTU16、OTU17、OTU18、OTU19、OTU21、OTU24；隸屬Nitrososphaeracluster的OTU有：OTU12、OTU14、OTU15、OTU20；隸屬Nitrosopumiluscluster的OTU有：OTU06、OTU07、OTU22、OTU23。

與沉積物和水體中AOAamoA基因的分布的比較發(fā)現(xiàn)，沉積物和水體的共有序列除OTU07外，均屬于Nitrososphaerasister group。水體中除OTU07和OTU20外，均屬于Nitrososphaerasister group。而沉積物中則包含檢測(cè)到的Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster中的大多數(shù)種類。各樣點(diǎn)沉積物和水體中AOA系統(tǒng)類群的組成情況見(jiàn)圖5，可以發(fā)現(xiàn)各樣點(diǎn)間的AOA組成存在一定差異，但從總體上來(lái)看，水體中的AOA比較單一，幾乎都為Nitrososphaerasister類群，而沉積物中Nitrososphaerasister類群雖然也占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但也包含相對(duì)較多的其他類群。

3 討論

已有研究表明AOA相比AOB更適合厭氧環(huán)境[8]，且在水體[9]和土壤[10]等環(huán)境中AOAamoA基因的豐度和多樣性都更為豐富。近年來(lái)已有相關(guān)研究證實(shí)了在養(yǎng)殖池塘中存在AOA，其中多數(shù)研究都能在沉積物中檢測(cè)到AOAamoA基因，而部分研究則未能在水體中檢測(cè)到AOA，這可能是受到光抑制的影響。在本研究中，我們基于amoA基因的克隆文庫(kù)技術(shù)，對(duì)主養(yǎng)草魚池塘中的AOA進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖池塘的沉積物和水體中均存在AOA，但二者中的分布存在著差異。

在早期的研究中，已發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)殖過(guò)程的推進(jìn)，池塘水體中的氨氧化微生物數(shù)量會(huì)下降，甚至難以檢測(cè)到氨氧化古菌[11]。在本研究中，通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖前期的分析發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖水體中均檢測(cè)到AOA的存在，說(shuō)明養(yǎng)殖過(guò)程可能會(huì)對(duì)池塘水體中的氨氧化古菌造成不利的影響。另外，對(duì)不同養(yǎng)殖區(qū)域沉積物和水體的比較發(fā)現(xiàn)，池塘沉積物中的AOA無(wú)論是種類數(shù)還是多樣性都要高于水體，而且高于在其他環(huán)境中檢測(cè)到的AOA OTU數(shù)目[12]，說(shuō)明養(yǎng)殖池塘沉積物中可能存在更為豐富的AOA種類。在養(yǎng)殖池塘的區(qū)域分布上，我們對(duì)不同樣點(diǎn)的比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1沉積物中的AOA種類數(shù)和多樣性都要低于F2和F3，但F1水體中的種類數(shù)和多樣性要高于F2和F3，說(shuō)明養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中的AOA存在著差異，AOA在二者中可能分別具有相對(duì)獨(dú)立的生態(tài)位。目前還沒(méi)有比較養(yǎng)殖環(huán)境中AOA在沉積物和水體中的分布規(guī)律，這可能有待進(jìn)一步研究。我們對(duì)沉積物和水體中OTU的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，沉積物和水體中除存在少量的共有OTU外，還分別具有各自獨(dú)立存在的OTU，但檢測(cè)到的OTU共有序列數(shù)量在總體上占據(jù)絕大優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明養(yǎng)殖環(huán)境中具有廣分布生態(tài)位的種類可能更具優(yōu)勢(shì)，但這還需要進(jìn)一步的研究。

圖4 基于amoA基因構(gòu)建的養(yǎng)殖池塘沉積物和水體中氨氧化古菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic analysis of archaeal amoA gene sequences retrieved from the aquaculture ponds of sediment and water

圖5 沉積物和水體中AOA系統(tǒng)類群的組成圖Fig.5 Composition of AOA species in sediment and water

從系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果來(lái)看，養(yǎng)殖池塘系統(tǒng)中的AOAamoA基因序列與來(lái)自土壤、沉積物、水體及部分污水處理系統(tǒng)的基因序列高度相似。本研究測(cè)得的AOA包括Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster類群。先前有研究表明在養(yǎng)殖池塘表層沉積物中的AOA主要屬于Nitrososphaera類群，而在較深層的沉積物中的AOA主要屬于Nitrosopumilus類群[11]，另外針對(duì)養(yǎng)殖池塘水體中的研究也證明AOA絕大多數(shù)屬于Nitrosopumilus類群[5]。這與本研究中的結(jié)果存在著一定的差異，本研究中測(cè)得的74%的OTU序列都屬于Nitrososphaerasister group，水體和沉積物共有的OTU除OTU07屬于Nitrosopumiluscluster外，其它序列均屬于Nitrososphaerasister類群；而沉積物中除包含少量的Nitrososphaera類群外，主要的OTU仍然為Nitrososphaerasister類群，這說(shuō)明Nitrososphaerasister類群可能是該主養(yǎng)草魚池塘中最重要的氨氧化功能類群。Nitrososphaerasister類群由Pester等[4]首次提出，與Nitrososphaera類群有共同的祖先，但與AOA其他類群分離開(kāi)來(lái)。雖然目前已發(fā)現(xiàn)Nitrososphaerasister類群在陸地環(huán)境中分布廣泛且數(shù)量豐富[12]，但關(guān)于該類群的了解還很少，甚至還存在一定的爭(zhēng)議。例如，有證據(jù)表明amoA相關(guān)的Thaumarchaeota為異養(yǎng)型或兼養(yǎng)型，因?yàn)樗鼈冊(cè)诩尤胗袡C(jī)物質(zhì)時(shí)生長(zhǎng)會(huì)加快[13]。而在其他的研究中，卻發(fā)現(xiàn)該類群的富集物能夠在自養(yǎng)條件下生長(zhǎng)[14]。另外在湖泊沉積物中也發(fā)現(xiàn)Nitrososphaerasister類群Thaumarchaeota能夠固定二氧化碳[15]。雖然在本研究中草魚池塘沉積物和水體中的高有機(jī)質(zhì)和氨氮水平可能有利于Nitrososphaerasister類群的發(fā)展，但其群落動(dòng)態(tài)和影響因素還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，在主養(yǎng)草魚養(yǎng)殖池塘的水體和沉積物中均存在較為豐富的AOA，且在水體和沉積物中的分布存在差異。AOA在養(yǎng)殖池塘不同區(qū)域中的分布也存在差異。AOA主要屬于Nitrososphaerasister group、Nitrososphaeracluster、Nitrosopumiluscluster，但Nitrososphaerasister group是優(yōu)勢(shì)種群，占了AOA種群的絕大部分。