王亞紅 王新強 湯建兒

手術切口疼痛是術后患者的常見并發(fā)癥，若不及時干預，可影響患者術后的康復，約30%～60%的患者即使給予積極鎮(zhèn)痛治療，后期仍可轉化為慢性疼痛，病程可達數(shù)月甚至數(shù)年，嚴重影響患者的工作和生活。嗎啡和芬太尼是臨床常用的阿片類鎮(zhèn)痛藥。研究認為，鞘內(nèi)注射嗎啡聯(lián)合芬太尼，二者可取長補短，芬太尼起效較快，可達快速鎮(zhèn)痛的目的，而嗎啡作用時間較長，可延長鎮(zhèn)痛時間［1］。但二者聯(lián)用副作用較大。研究［2］顯示，鞘內(nèi)注射納洛酮1.0ng/kg 聯(lián)合嗎啡、芬太尼可抑制切口痛大鼠海馬MTL 表達上調(diào)，進而參與維持胃腸動力的穩(wěn)定，有利于藥物副作用的改善，且未減弱嗎啡聯(lián)合芬太尼的鎮(zhèn)痛效應。手術切口除引起疼痛外，還可引起切口處的炎癥反應，加重疼痛程度［3］。本文探討小劑量納洛酮聯(lián)合嗎啡、芬太尼對大鼠后足切割痛覺及尾椎間盤炎癥因子的表達的影響。報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40 只健康雄性SD 大鼠，SPF 級，6～8周齡，體重180～220g，購自上海醫(yī)學動物實驗中心，每籠5 只，自然照明，自由攝食和飲水。采用隨機數(shù)字表法隨機分為4 組：正常對照組（A 組）、手術切口組（B 組）、B 組基礎上1.0ng/kg 納洛酮+嗎啡+芬太尼組（C 組）、B 組基礎上嗎啡+芬太尼10mg/kg 組（D組），每組10 只。實驗時間2018 年1 月至9 月。

1.2 建模方法 B、C、D 組大鼠均給予戊巴比妥麻醉，麻醉完全后，常規(guī)備皮消毒，依據(jù)Brennan 法建立大鼠切口痛模型，具體方法：在距足跟近端0.5cm 至足趾長約1cm 的位置，切開皮膚和筋膜后，用鑷子夾住足底肌肉并做一縱向切口，注意保持肌肉的完整性。按壓止血后，用細線縫合皮膚，制成雙針切口疼痛模型。所有操作時間均控制在5min 內(nèi)完成。手術后，對切口進行消毒，并給予紅霉素眼膏抗感染。隨后，用特制的大鼠固定籠固定大鼠，采用SH-XYT 微型動物壓痛儀（深圳市凱強力有限公司）測量雙側后肢及其側面的疼痛閾值。該實驗嚴格按照國際疼痛學會（IAP）指南進行操作。A 組大鼠正常喂養(yǎng)，不給予造模。

1.3 處理方法 切口疼痛模型建立20min 時，D 組鞘內(nèi)注射嗎啡5μg/kg+芬太尼0.25μg/kg 的混合液，C 組鞘內(nèi)注射納洛酮1.0ng/kg+嗎啡5μg/kg+芬太尼0.25μg/kg 的混合液。A 組和B 組同時鞘內(nèi)注射相同劑量的生理鹽水。

1.4 行為學觀察 鞘內(nèi)注射藥物5min 后，評估大鼠的疼痛行為。大鼠清醒后，觀察后爪著陸和負荷，且后爪被壓縮并變白以指示負重。后爪被抬起并計數(shù)，2分；后爪接地但未加載，1 分；后爪接地并裝載，0 分。1 次/5min 觀察大鼠疼痛行為變化，1min/次，以1min內(nèi)最常采取的姿勢作為觀察標準，連續(xù)觀察1h（總分24 分）。累積疼痛評分=側足評分-對側足部評分。

1.5 Real-time PCR 檢測方法 取大鼠尾椎間盤樣品，在液氮中速凍后快速進行研磨，按照RNA 提取試劑盒說明書的操作提取細胞總RNA，經(jīng)Qubit Fluorometer檢測RNA 的濃度及純度，按逆轉錄試劑盒說明書，將總RNA 反轉錄cDNA，Real-time PCR 檢測相關基因。在NCBI 數(shù)據(jù)庫中查詢目的基因的mRNA 序列，設計Real-time PCR 引 物，TLR4、MyD88、NF-κB 及 TNF-α 的引物委托北京六合華大基因合成，檢測每個目的基因擴增的Ct 值，Ct 值與DNA 起始拷貝數(shù)呈負相關性，以雙△Ct 值法計算靶基因的相對表達水平：三次平行重復實驗的平均值作為每個樣本的CT 值，△CT=CT（Target Gene）-CT（內(nèi)參），反轉錄體系為（20μl）：5×SYBR Green 實 時PCR 預 混 液4μl；iScript reverse transciptase 1μl；RNA template（1μg RNA）1μg。PCR 反 應 中 引 物 濃 度 為300～450nM，cDNA 模板100ng，反應參數(shù)為：預變性95℃～10min，變性 95℃～10s，退火Tm-6℃～20s，延伸72℃～33s，循環(huán)次數(shù)為40。

1.6 ELISA 檢測方法 大鼠尾椎間盤樣本TLR4、MyD88、NF-κB 及TNF-α、IL-6、IL-1β 的 定 量檢測使用ELISA 檢測試劑盒。設置標準孔、待測樣品孔、空白孔。標準孔加入不同濃度的標準品，并加入待測樣品，37℃孵育2h；每孔加入檢測溶液（生物素化的一抗）100μl，酶標板加上覆膜，37℃孵育1h；棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μl 洗滌液洗滌，浸泡1～2min，重復洗板3 次；每孔加入HRP 標記的二抗100μl，酶標板加上覆膜，37℃孵育，30min；每孔加入90μl TMB 底物，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色15～25min；當標準孔的前3～4 孔出現(xiàn)明顯梯度藍色，終止反應，加入50μl 2M H2SO4；立即用酶標儀在450nm 處測量各孔的OD 值。

1.7 Western blot 取大鼠尾椎間盤樣本，在液氮中快速研磨后，加入ReadyPrep 蛋白質(zhì)萃取試劑提取組織的總蛋白，冰上進行適當頻率的短促沖擊，裂解混合物于4℃，13000r/min 離心20min。吸取上清液置于新的離心管中，用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳，電泳后凝膠浸于轉移緩沖液中平衡10min，裝配轉移“三明治”，電壓100V，轉膜45～60min。轉膜完成后，用TBS 漂洗PVDF 膜10～15min；加入合適稀釋度的一抗TLR4、MyD88、NF-κB 及TNF-α［用含1%（w/v）脫脂牛奶的TBST稀釋］，室溫孵育2h，TBST 漂洗膜3 次，5～10min/次；用含0.05%（w/v）脫脂牛奶的TBST 稀釋的二抗（1：10000，HRP 標記）孵育膜；TBST 漂洗膜3 次，5～10min/次。曝光，照相保存實驗結果。Quantity one v4.62 軟件分子條帶灰度值（條帶軌跡定量法），以目的蛋白/內(nèi)參蛋白的半定量數(shù)值作為定量依據(jù)，并作統(tǒng)計分析。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用百分比表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ELISA 法分析各組尾椎間盤中炎癥TLR4/NF-κB 通路信號分子變化 與A 組比較，B 組大鼠尾椎間盤TLR4/ NF-κB 信 號 通 路TLR-4、MyD88、NF-κB、TNF-α 表達增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與B 組比較，C 組和D 組大鼠尾椎間盤TLR-4、MyD88、NF-κB、TNF-α 表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且C 組大鼠尾椎間盤TLR-4、MyD88、NFκB、TNF-α 表達顯著低于D 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組尾椎間盤中TLR4/NF-κB通路信號分子變化（±s）

表1 各組尾椎間盤中TLR4/NF-κB通路信號分子變化（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與D組比較，#P＜0.05

分組 n TLR4（ng/ml） MyD88（ng/ml） NF-κB P65（pg/ml） TNF-α（pg/ml）A組 10 0.71±0.21 0.42±0.19 4.27±0.54 28.24±4.65 B組 10 26.86±2.30* 17.68±1.92* 66.26±4.15* 176.42±10.21*C組 10 12.57±2.89*△# 8.21±2.01*△# 23.02±3.84*△# 68.57±10.37*△#D組 10 18.57±3.84*△ 12.24±2.54*△ 38.85±8.65*△ 89.24±10.44*△

2.2 ELISA 檢測方法分析各組尾椎間盤炎癥因子IL-6、IL-1β 表達影響 與A 組比較，B 組大鼠尾椎間盤IL-6、IL-1β 表達增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與B 組比較，C 組和D 組大鼠尾椎間盤IL-6、IL-1β 表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且C 組大鼠尾椎間盤IL-6、IL-1β 顯著低于D 組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組尾椎間盤炎癥因子IL-6、IL-1β表達（±s）

表2 各組尾椎間盤炎癥因子IL-6、IL-1β表達（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與D組比較，#P＜0.05

分組 n IL-6（ng/ml） IL-1β（pg/ml）A組 10 0.71±0.21 28.24±4.65 B組 10 26.86±2.30* 178.42±10.21*C組 10 5.58±2.57*△# 35.54±10.74*△#D組 10 10.24±2.34*△ 78.24±10.3*△

2.3 各組累積疼痛評分 與A 組比較，B 組大鼠術后累積疼痛評分增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與B 組比較，C 組和D 組大鼠的累積疼痛評分減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且C 組大鼠累積疼痛評分顯著低于D 組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組累積疼痛評分［分，（±s）］

表3 各組累積疼痛評分［分，（±s）］

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與D組比較，#P＜0.05

分組 n 鞘內(nèi)注射前 鞘內(nèi)注射后6h 鞘內(nèi)注射后24h 鞘內(nèi)注射后48h A組 6 1.54±1.54 1.45±0.56 1.36±0.75 1.24±0.52 B組 6 20.86±2.30* 19.46±4.15* 13.46±4.45* 10.46±4.64*C組 6 19.24±3.58* 3.58±0.44*△# 2.58±0.45*△# 1.98±0.56*△#D組 6 19.54±3.14* 10.24±3.65*△ 7.24±3.54*△ 5.24±3.44*△

2.4 各組尾椎間盤中炎癥TLR4/NF-κB 通路信號分子變化 與A 組相比，B 組大鼠尾椎間盤TLR4/ NF-κB信號通路TLR-4、MyD88、NF-κB、TNF-α 蛋白表達增強，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與B 組相比，C 組和D 組大鼠尾椎間盤TLR-4、MyD88、NF-κB、TNF-α 蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且C 組大鼠TLR-4、MyD88、NF-κB、TNF-α 蛋白表達顯著低于D 組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western blot法分析各組尾椎間盤中炎癥TLR4/NF-κB 通路信號分子變化

3 討論

術后疼痛是手術創(chuàng)傷后常見的癥狀［4］。疼痛的控制對術后康復及手術效果具有直接的影響作用［5］。術后切割痛是常見的急性疼痛，主要包括機械誘發(fā)的疼痛與靜息狀態(tài)下的疼痛，以往切口痛模型研究主要采用化學刺激產(chǎn)生的疼痛模型，但上述疼痛模型無論是疼痛過程還是疼痛機制均與創(chuàng)傷性疼痛的病理過程存在一定差異［6-7］。隨著臨床疼痛動物模型的不斷發(fā)展，加速人們對臨床疼痛癥狀的認識，因此，采用切割刺激模擬患者術后疼痛是最佳模型，較以往疼痛模型更能反映患者術后的應激狀態(tài)與疼痛模式。本實驗通過建立大鼠切割痛模型，以模擬術后切口的疼痛模式［8］，結果顯示，與正常對照組比較，其余各組大鼠術后累積疼痛評分顯著增加，提示大鼠切割痛模型造模成功。

嗎啡和芬太尼是臨床常用阿片類鎮(zhèn)痛藥，鞘內(nèi)注射嗎啡鎮(zhèn)痛作用起效較慢，血藥濃度達到峰值時間約6h，但作用持久［9］；而鞘內(nèi)注射芬太尼起效較快，血藥濃度達到峰值時間約1h，但半衰期較短，二者聯(lián)合應用可產(chǎn)生協(xié)同作用，聯(lián)合鎮(zhèn)痛作用加強［10］。通過成功模擬慢性神經(jīng)病理性疼痛模型給予上述藥物治療，結果顯示，嗎啡和芬太尼聯(lián)合應用大鼠術后累積疼痛評分顯著低于模型組，提示二者聯(lián)合應用可顯著減輕大鼠后足切割痛覺程度。納洛酮是阿片受體拮抗劑，可拮抗因過量服用阿片類藥物產(chǎn)生的各種毒副作用［11］。近年研究顯示［12］，小劑量的納洛酮除能夠拮抗或減輕嗎啡的各種毒副作用，同時還能夠增強嗎啡的鎮(zhèn)痛作用。但能夠增強嗎啡鎮(zhèn)痛效能的納洛酮劑量范圍尚未確定。高明龍等［13］研究顯示，1～100ng/kg的納洛酮能顯著增強嗎啡對大鼠鎮(zhèn)痛效能，但具體作用機制尚不明確。本實驗結果顯示，鞘內(nèi)注射小劑量納洛酮、嗎啡混合芬太尼對大鼠后足切割痛覺的術后累積疼痛評分顯著降低，優(yōu)于嗎啡聯(lián)合芬太尼治療，提示小劑量納洛酮可顯著增強嗎啡聯(lián)合芬太尼對切割痛大鼠的鎮(zhèn)痛效能。

研究發(fā)現(xiàn)，免疫應答［14］和炎性反應［15］在術后疼痛的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。TLR 受體介導的信號通路在病原微生物引起的天然免疫和獲得性免疫反應中發(fā)揮重要作用。TLR4、MyD88、NF-κB P65、TNF-α 是TLR4/ NF-κB 信號通路中具有代表性的受體［16-17］。TLR4 受體在病原微生物的刺激下，通過識別病原體相關分子模式（PAMP）向細胞內(nèi)胞內(nèi)傳遞信號，通過MyD88 的轉接等介導多種跨膜信號激活下游NF-κB 等信號轉錄因子［18］，引起IL-1、IL-6、IL-8、IL-10 和TNF-α 等多種炎性因子的釋放，進一步導致炎性反應擴大。其中，TLR4 起主導角色。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB 信號通路參與切口損傷后炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展［19］。在切口損傷的刺激下，可進一步激活中樞免疫細胞，促進IL-1、IL-6、IL-8 等炎性因子的分泌，導致炎癥級聯(lián)反應的進一步擴大，促進脊髓水平的信號的傳導過程，導致痛覺過敏，同時，神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，還可進一步激活損傷神經(jīng)處NF-κB 信號轉導通路及其下游的炎癥介質(zhì)，進一步加重炎癥反應［20］。本研究發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白在切口痛模型大鼠中的表達上調(diào)，同時尾椎間盤IL-6、IL-1β表達增強，提示TLR4/NF-κB 信號通路參與了切口損傷的炎癥反應過程。而給予小劑量納洛酮聯(lián)合嗎啡、芬太尼后大鼠尾椎間盤的TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白及IL-6、IL-1β 表達顯著下調(diào)，表明小劑量納洛酮聯(lián)合嗎啡、芬太尼可能通過抑制其尾椎間盤炎癥TLR4/ NF-κB 信號通路及IL-6、IL-1β 的表達發(fā)揮增強鎮(zhèn)痛效能的作用。

綜上所述，鞘內(nèi)注射小劑量納洛酮聯(lián)合嗎啡、芬太尼對切口痛大鼠具有較好的鎮(zhèn)痛效果，并能夠抑制其尾椎間盤炎癥TLR4/ NF-κB 信號通路及IL-6、IL-1β 的表達，提示其鎮(zhèn)痛機制可能是通過抑制炎癥TLR4/ NF-κB 信號通路及炎癥因子的表達而實現(xiàn)。