馬慶慶 (貴州航天醫(yī)院中心實驗室，貴州 遵義 563000)

肝細(xì)胞癌作為全球第六大常見癌癥和我國最常見的惡性腫瘤之一，早期診斷困難且臨床病程短、疾病進展迅速，臨床治療方式主要為手術(shù)切除。但因確診延遲致使多數(shù)患者喪失手術(shù)時機，中位生存期僅3～6個月，病死率較高[1]。10-羥基喜樹堿(10-Hydroxycamptothecin，HCTP)是從珙桐科植物喜樹中提取純化的一萜烯生物堿類化合物，屬于細(xì)胞S期特異性抗腫瘤藥物，能通過有效抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶-I ( TopoisomeraseⅠDNA,Topo-I-DNA) 的合成抑制癌細(xì)胞增殖，進而延緩腫瘤細(xì)胞生長，具有較強的抗癌活性[2]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine - induced killer ,CIK) 是一類兼具T淋巴細(xì)胞(T-lymphocyte，T cells)和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK- cell)雙重功能的殺瘤細(xì)胞[3], 不僅有針對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷，且對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用小。CIK細(xì)胞可通過白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)和CD3單克隆抗體等細(xì)胞因子共同刺激患者外周血單個核細(xì)胞體外培養(yǎng)制備, 包括CD3+CD8+細(xì)胞、CD3+CD56+細(xì)胞和NK細(xì)胞[4]。日本的臨床試驗報道，CIK細(xì)胞免疫療法降低了腫瘤切除術(shù)后的復(fù)發(fā)率[5]。本研究旨在評估體外CIK細(xì)胞和HCPT聯(lián)合作用對人肝癌BEL-7402細(xì)胞株的協(xié)同效應(yīng)。

1 資料與方法

1.1一般資料：HCPT購自Sigma公司，原藥以二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解并配成80 mmol/L貯存液, 每管1.0 mL分裝后-20℃貯存?zhèn)溆茫?Ficoll人類淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限公司； RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)購自華大基因生物技術(shù)有限公司；CD3單克隆抗體購自美國Sigma公司；基因重組人IL-2、白細(xì)胞介素-1α(Interleukin-1α，IL-lα)購自美國Peprotech公司； AnnexinV -FITC 和PI試劑購自德國Miltenyi公司；人肝癌BEL-7402細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2方法

1.2.1CIK細(xì)胞制備：在取得健康志愿者知情同意的前提下采集外周新鮮血液50 ml，應(yīng)用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，將分離池的PBMC置于含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基中洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。將PBMC按1×106/ml的濃度懸浮于HL-1TM含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入INF-γ(1 000 U/ml)，在5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)24 h后加入CD3單抗(50 ng/ml)、IL-2(300 U/ml)、IL-lα(100 U/mL)。每3天半量換液一次，并補加IL-2(300 U/ml)，在培養(yǎng)第7天和第14天，顯微鏡觀察并計數(shù)細(xì)胞量和活力(活細(xì)胞應(yīng)>80%)，動態(tài)觀察CIK細(xì)胞增殖情況[6]。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)鑒定CIK細(xì)胞免疫表型：收集培養(yǎng)至第14天的成熟CIK細(xì)胞，用含異硫氰酸熒光素的CD3抗體[3',6'-dihydroxy-5-isothiocyanato-3H-spiro(isobenzofuran-1,9'-xanthen)-3-one CD3 antibody，anti-CD3-FITC], anti- CD4-FITC，anti- CD8-PE，anti-CD56-PC5抗體標(biāo)記，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達(dá)[7]，并以健康志愿者新分離的PBMC作為對照。實驗重復(fù)三次以減少誤差。

1.2.3人肝癌BEL-7402細(xì)胞制備：將人肝癌BEL-7402細(xì)胞復(fù)蘇株后常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d左右達(dá)細(xì)胞對數(shù)生長期后收集備用。

1.2.4HCPT的配制：用生理鹽水溶解HCPT晶體并稀釋其濃度為1 g/L貯存液, 每管1.0 ml分裝后 -20℃保存, 使用時取出并用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)稀釋至所需濃度。

1.2.5MTT法檢測HCPT對BEL-7402細(xì)胞增殖的抑制：取對數(shù)生長期的BEL-7402細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml后接種于96孔板中, 5% CO2，37°C孵箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加入終濃度(共9個濃度)分別為0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1、2、4和8 mg/L的HCPT 溶液[8]；同時設(shè)BEL-7402 空白對照，每個濃度重復(fù)3孔。分別培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h三個時間點后每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h后加入DMSO終止培養(yǎng)，酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測各孔吸光度(absorbance，A值)。

1.2.6MTT法檢測CIK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷活性：取對數(shù)生長期的BEL-7402細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml后接種于96孔板中, 5% CO2，37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加入CIK細(xì)胞，按效靶比[9](Effective target ratio,E∶T) 5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1五種比例接種于對應(yīng)的96孔板中；同時設(shè)BEL-7402細(xì)胞對照孔，每個濃度重復(fù)3孔。分別培養(yǎng)至24 h、48 h、72h三個時間點后每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h后加入DMSO終止培養(yǎng)，酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測各孔A值。

1.2.7MTT法檢測CIK細(xì)胞和HCPT聯(lián)合應(yīng)用對BEL-7402細(xì)胞的殺傷活性：取對數(shù)生長期的BEL-7402細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml后接種于96孔板中, 5% CO2，37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加入含HCPT(前文中確定的HCPT最佳作用濃度)的DMSO溶液和CIK細(xì)胞(前文中確定的最佳CIK細(xì)胞E∶T 比例)；同時設(shè)BEL-7402細(xì)胞對照孔，每個濃度重復(fù)3孔。對照組(僅10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液)、HCPT組(含HCPT 0.5 mg/L )、CIK組(E∶T=20∶1)、協(xié)同組(HCPT 0.5 mg/L +CIK E:T=20∶1)5% CO2，37 ℃孵箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，PBS洗滌兩次，重懸細(xì)胞，使其濃度為1×106/ml。加入DMSO終止培養(yǎng)，酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測各孔A值。

2 結(jié)果

2.1CIK細(xì)胞觀察：CIK細(xì)胞培養(yǎng)至第7天和第14天，計數(shù)細(xì)胞量和活力(活細(xì)胞應(yīng)>80%)，動態(tài)觀察CIK細(xì)胞增殖情況，見圖1。

A圖為培養(yǎng)培養(yǎng)7 d后的CIK 細(xì)胞形態(tài)，B圖為培養(yǎng)14 d后CIK 細(xì)胞形態(tài)

2.2流式細(xì)胞術(shù)鑒定CIK細(xì)胞免疫表型：本研究采用含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基用于CIK細(xì)胞增殖，效果優(yōu)于無血清培養(yǎng)基。收集培養(yǎng)至第14天的成熟CIK細(xì)胞，以健康志愿者新分離的PBMC為對照，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達(dá)，結(jié)果顯示CD3+CD56+細(xì)胞比例可達(dá)23%。見圖2。

2.3HCPT對BEL-7402細(xì)胞增殖的抑制：通過MTT法檢測不同濃度HCPT對BEL-7402細(xì)胞增殖的抑制，酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測各孔A值(以mean±SD表示)，計算增殖抑制率[10]。增殖抑制率=[(1-實驗組A值)/對照組A值]×100% 。確定了本實驗HCPT的最佳作用濃度為0.5 mg/L。詳見表1和圖3。

2.4CIK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷活性：通過MTT法檢測CIK細(xì)胞不同E∶T對BEL-7402細(xì)胞增殖的抑制，酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測各孔A值(以mean±SD表示)，計算增殖抑制率[10]。增殖抑制率=[(1-實驗組A值)/對照組A值]×100% 。確定了本實驗CIK細(xì)胞的最佳E∶T為和20∶l，詳見表2和圖4。

左圖為培養(yǎng)14 d后CIK細(xì)胞表達(dá)CD3+CD8+的流式細(xì)胞圖，右圖為培養(yǎng)14 d后CIK細(xì)胞表達(dá)CD3+CD56+的流式細(xì)胞圖

表1 不同濃度HCPT對BEL-7402細(xì)胞的作用[A值，mean±SD]

HCTP(mg/L)24 h48 h72 hControl0.641±0.0380.780±0.0351.069±0.0360.0310.620±0.0350.759±0.0361.042±0.0380.0630.611±0.0370.732±0.0331.018±0.0340.1250.592±0.0340.701±0.0340.853±0.0350.2500.523±0.0310.615±0.0320.688±0.0320.5000.466±0.0360.524±0.0330.554±0.0341.0000.341±0.0320.441±0.0310.491±0.0312.0000.349±0.0310.340±0.0320.470±0.0324.0000.337±0.0340.382±0.0330.448±0.0358.0000.322±0.0370.379±0.0320.406±0.033

圖3 不同濃度HTCP對BEL-7402細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.5CIK細(xì)胞和HCPT的聯(lián)合應(yīng)用對BEL-7402細(xì)胞的殺傷活性：收集HCPT組(含HCPT 0.5 mg/L)、CIK細(xì)胞組(E∶T=20∶1)、HCPT + CIK細(xì)胞組(HCPT0.5 mg/L +CIK細(xì)胞E∶T=20∶1)處理24 h、48 h、72 h后的BEL-7402細(xì)胞，PBS洗滌兩次后重懸細(xì)胞至濃度為1×106/ml，加入DMSO終止培養(yǎng)，酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測各孔A值。結(jié)果顯示，HCPT + CIK細(xì)胞組對肝癌BEL-7402細(xì)胞的殺傷作用明顯，較單用HCPT組或單用CIK細(xì)胞組具有顯著優(yōu)勢(P<0.001)。詳見表3。

E∶T24 h48 h72 hControl0.638±0.0460.776±0.0451.064±0.0435∶10.462±0.0450.518±0.0430.551±0.04410∶10.347±0.0430.439±0.0420.489±0.04120∶10.332±0.0410.337±0.0410.428±0.04230∶10.349±0.0440.373±0.0440.446±0.04340∶10.351±0.0430.366±0.0420.451±0.041

圖4 不同濃度效靶比CIK細(xì)胞對BEL-7402細(xì)胞增值抑制率的影響

組別孔數(shù)藥物作用時間24 h48 h72 hHCTP組1220.36±0.8928.91±1.5739.24±2.96CIK細(xì)胞組1221.73±0.7530.34±1.2841.67±2.81HCPT+CIK細(xì)胞組1235.04±0.9148.95±1.7456.36±2.48P值<0.001<0.001<0.001

3 討論

HCPT可與Topo-I-DNA結(jié)合形成復(fù)合物，在 DNA 在大量復(fù)制活躍的S期， Topo Ⅰ剪切 DNA 雙鏈，形成TopoⅠ-DNA的可裂解復(fù)合物。通過阻斷DNA重構(gòu)使雙鏈DNA斷裂，并在機體多種蛋白的協(xié)同作用下導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡，對多種惡性腫瘤療效確切[11]。CIK細(xì)胞通過強大的細(xì)胞毒性作用，可通過直接殺傷、誘導(dǎo)凋亡和壞死等效應(yīng)抑制腫瘤細(xì)胞生長，是當(dāng)前臨床上最廣泛且常用的過繼性細(xì)胞免疫治療。研究表明，CIK細(xì)胞免疫輔助治療能顯著改善早期肝癌患者的預(yù)后，提高免疫治療療效的機制與其的細(xì)胞群組成密切相關(guān)[12]。

本研究通過采集健康志愿者外周新鮮血液，培養(yǎng)誘導(dǎo)成熟的 CIK細(xì)胞，在體外與肝癌BEL-7402 細(xì)胞共同培養(yǎng)，同時聯(lián)合HCPT研究對肝癌BEL-7402 細(xì)胞的凋亡作用，其機制[13]主要為CD3+CD56+細(xì)胞有效地殺瘤作用和HCPT阻斷通過Topo-I-DNA而發(fā)揮的至癌細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用，通過MTT法選定HCPT的最佳濃度為0.5 mg/L，CIK細(xì)胞的最佳效靶比為20∶1。研究發(fā)現(xiàn)[14]，HCPT聯(lián)合CIK細(xì)胞對肝癌BEL-7402細(xì)胞的作用中，自身免疫環(huán)境發(fā)生變化，聯(lián)合作用與單獨作用相比具有協(xié)同效應(yīng)，結(jié)果提示HCPT聯(lián)合CIK細(xì)胞對肝癌BEL-7402細(xì)胞的抑制作用強于單用HCPT或CIK細(xì)胞治療，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且存在著時間和劑量的依賴[15]。

綜上所述，HCPT聯(lián)合CIK細(xì)胞對肝癌BEL-7402細(xì)胞具有良好的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，有望給臨床治療提供支撐。