宛柏杰，劉 凱，趙紹路，朱靜雯，劉艷艷，張桂云，朱國永，王愛民，唐紅生，孫明法，嚴(yán)國紅

(江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224000)

【研究意義】稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的水稻重要病害之一，對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響，嚴(yán)重時可造成減產(chǎn)40 %～50 %，甚至顆粒無收[1]。選育和利用抗病品種，是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一，但由于稻瘟病菌存在多個生理小種以及生理小種不斷的分化，抗譜較窄的品種往往在推廣幾年后抗病性就可能出現(xiàn)降低[2-3]。育種實踐證明，將具有不同抗譜的稻瘟病抗性基因聚合到同一個品種中，可以有效提高品種抗稻瘟病的持久性[4]。在傳統(tǒng)育種中，水稻稻瘟病抗性育種主要依賴于接種鑒定和表型選擇，而且需要育種者具有幾年甚至十幾年的育種經(jīng)驗，鑒定結(jié)果往往容易造成誤差，甚至抗性基因的丟失，選擇效率低，選育周期長[5]。近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，水稻抗性育種已經(jīng)進(jìn)入生物技術(shù)與常規(guī)技術(shù)相結(jié)合的階段，以分子標(biāo)記輔助選擇、多基因聚合等分子育種技術(shù)已經(jīng)成為抗性育種的主要方向[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前研究發(fā)現(xiàn)，在不同抗病品種中，已經(jīng)鑒定出80多個稻瘟病抗性基因，其中30多個抗稻瘟病基因已經(jīng)被克隆[7]。這些基因成簇地分布于除第3 染色體外的其他染色體上[8-10]。隨著稻瘟病抗性基因Pi-b第一個被成功克隆，越來越多新的稻瘟病抗性基因通過圖位克隆、等位基因挖掘、無毒基因與抗性基因互作等策略得到分離。Pi-b基因位于水稻第2染色體長臂末端附近的區(qū)域，編碼由1251個氨基酸殘基組成的含1個核苷酸結(jié)合位點和富含亮氨酸重復(fù)的蛋白質(zhì)[11-12]。Pi-ta基因位于水稻第12 染色體靠近著絲點附近的區(qū)域，包含2個外顯子和1個1463 bp的內(nèi)含子，編碼1個長度為 928個氨基酸的細(xì)胞質(zhì)膜受體蛋白[13]。Bryan等研究發(fā)現(xiàn)Pi-ta基因的編碼產(chǎn)物能與稻瘟病菌的無毒基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用引發(fā)抗病反應(yīng)[14]。Pi54定位于水稻第11染色體上，對稻瘟病菌具有廣譜抗性[15]。Sharma等克隆了Pi54基因，在抗病品種Tetep中，Pi54僅包含1個外顯子，編碼 1個由330氨基酸組成的NBS-LRR類抗病蛋白[16]。Pigm抗性基因來源于我國地方品種谷梅4號，由1對顯性基因控制，該基因抗譜廣，對9個來自中國不同品系的生理小種均表現(xiàn)出良好抗性[17]。宋兆強(qiáng)等對60 份品系進(jìn)行了基因檢測，解析了稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi-km在稻瘟病抗性育種中的作用[18]。大量抗稻瘟病基因的定位與克隆，對通過分子標(biāo)記輔助選擇培育具有持久抗性的水稻品種起到了極大地推動作用。【本研究切入點】本研究利用水稻稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54的分子標(biāo)記對80份通過傳統(tǒng)育種方法選育出來的抗病材料進(jìn)行基因檢測，并結(jié)合連續(xù)兩年人工穗頸瘟接種鑒定結(jié)果，對抗病基因進(jìn)行穗頸瘟抗性評價?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確不同抗病基因型對稻瘟病菌的抗病性，有針對性的進(jìn)行抗性基因的聚合，為篩選廣譜抗稻瘟病水稻品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻材料為江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所經(jīng)過多年稻瘟病菌圃鑒定篩選出來的抗病育種骨干粳稻親本80份，依次編號為GP1～GP80。

1.2 稻瘟病抗性基因的標(biāo)記檢測

DNA提取與稻瘟病基因功能標(biāo)記的檢測參考范學(xué)軍等的方法[19]。抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54引物設(shè)計參照陳鋒等和呂學(xué)蓮等[20-21](表1)，利用這些功能和連鎖標(biāo)記檢測試驗材料。利用Pi-ta引物檢測到1024 bp片段，并且NPi-ta引物擴(kuò)增不出目的片段，說明材料含有Pi-ta基因；利用Pi-b引物檢測到365 bp片段，并且NPi-b引物擴(kuò)增不出目的片段，說明材料含有Pi-b基因。而Pi-b引物檢測不出目的片段，但NPi-b引物擴(kuò)增803 bp片段，說明該材料攜帶有感病基因；抗病基因Pigm引物可以擴(kuò)增出856 bp大小的目的片段，說明材料中含有抗病基因Pigm，沒有擴(kuò)增出目的基因片段，說明材料不含有Pigm基因；抗病基因Pi54標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，擴(kuò)增片段216 bp(抗)/359 bp(感)。

1.3 稻瘟病抗性鑒定與評價

1.3.1 抗性鑒定 試驗在本所南洋試驗基地進(jìn)行，5月8日播種各試驗材料，30 d后移栽，單本載插，每區(qū)3行，每行8株，株行距13.3 cm×25.0 cm，整個生育期內(nèi)不防治病害，蟲害防治和肥水管理參考大田生產(chǎn)。

抗性鑒定菌株為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，包括近年來江蘇省內(nèi)稻瘟病菌優(yōu)勢小種以及各群小種的代表菌株，2016 年接種鑒定的稻瘟病菌代表菌株: ZB7、ZC11、ZD5、ZE3、ZF1 和ZG1；2017年接種鑒定的稻瘟病菌代表菌株: ZB3、ZC11、ZD7、ZE3、ZF1 和ZG1。將稻瘟病菌株混合，在水稻孕穗至破口期，參照于苗苗等人工注射接種的方法[17]，進(jìn)行水稻穗頸瘟的抗性鑒定，水稻成熟后進(jìn)行水稻穗頸瘟的抗性調(diào)查。

1.3.2 抗性評價 齊穗后30 d調(diào)查每個株系的穗發(fā)病情況，調(diào)查與評價方法參照DB32/T1123-2007《江蘇省稻瘟病鑒定方法與抗性評價技術(shù)規(guī)程》劃分抗感類型和病級(表2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料抗性基因分析

利用水稻稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54的功能標(biāo)記對80份育種材料進(jìn)行檢測(圖1，表3)，結(jié)果顯示：含有1個抗性基因的材料有12份，占總材料的15 %；含有2個抗性基因的材料有40份，占總材料的50 %；含有3個抗性基因的材料有21份，占總材料的26.25 %；含有4個抗性基因的材料有1份，占總材料的1.25 %；4個抗性基因均沒有的材料有6份，占總材料的7.5 %。

表1 PCR引物名稱、序列及片段大小Table 1 Name, sequences and fragment size of specific primers used for PCR

表2 水稻品種穗頸瘟調(diào)查抗性分級和抗性評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Investigation and evaluation criteria of resistance of rice varieties to neck blast

2.2 水稻穗頸瘟抗性鑒定

采用人工接種的方法，進(jìn)行水稻穗頸瘟抗性鑒定。在2016年穗頸瘟接種鑒定中，80份試驗材料中未發(fā)現(xiàn)0級免疫的材料，1級高抗的有38份，2級中抗的有21份，3級感病的有18份，4級高感的有3份。在2017年穗頸瘟接種鑒定中，80份試驗材料中未發(fā)現(xiàn)0級免疫的材料，1級高抗的有22份，2級中抗的有22份，3級感病的有20份，4級高感的有16份。從連續(xù)兩年的接種結(jié)果可以看出，抗病材料數(shù)量在逐漸減少，感病材料數(shù)量在逐漸增加。

圖1 標(biāo)記Pi-ta、Npi-ta、Pi-b、Npi-b、Pigm和 Pi54在部分品種中的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of PCR using functional marker of Pi-ta, Npi-ta, Pi-b, Npi-b, Pigm, and Pi54 in part varieties

表3 80份試驗材料穗頸瘟抗性鑒定與標(biāo)記檢測Table 3 Identification of resistance for panicle blast and marker detection for 80 test materials

表4 不同抗性基因組合的抗病性Table 4 Rice blast resistances of different genes and gene combinations

2.3 抗性基因分布與抗性相關(guān)性分析

通過對供試材料中4個抗性基因分布與抗性相關(guān)性分析表明(表4)，80份試驗材料中，兩年穗頸瘟鑒定都表現(xiàn)為感病的有21份，檢測到的抗性基因不超過2個，其中含Pi-b基因的材料有10份，含Pi54基因的材料有13份，沒有檢測到4個抗性基因的材料有4份。第1年接種鑒定表現(xiàn)為抗病，但第2年表現(xiàn)為感病的材料，總共有15份，除有3份材料沒有檢測到Pi-ta基因外，其余都檢測到Pi-ta基因，表明2017年P(guān)i-ta基因?qū)Φ疚敛】剐运皆谙陆怠：?個抗性基因的材料有21份，其中兩年表現(xiàn)均為抗病的有17份，其余4份第1年表現(xiàn)為抗病，第2年表現(xiàn)為感病，基因型為Pi-ta+Pi-b+Pigm。含有4個抗性基因的材料有1份，兩年接種結(jié)果都表現(xiàn)為抗病。

3 討 論

與傳統(tǒng)的水稻抗病育種相比較，利用分子標(biāo)記輔助選擇育種，具有快速、簡便、不受水稻生育期和環(huán)境影響的特點。范方軍等[19]利用水稻抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-km和Pi54的功能標(biāo)記檢測64份水稻品系，結(jié)果表明，抗稻瘟病基因Pi-ta與穗頸瘟存在顯著相關(guān)性。戴小軍等[22]利用水稻抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi9和Pi-km的分子標(biāo)記，對抗性基因與抗性反應(yīng)相關(guān)性進(jìn)行探討，結(jié)果表明，以Pi9為主效基因，同時聚合Pi-ta和Pi-b可以持久提高抗稻瘟病能力。王軍等[23]利用4個抗稻瘟病基因分子標(biāo)記，檢測2007-2013年江蘇省審定的粳稻品種，結(jié)果顯示稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pi-km與穗頸瘟的抗性呈正相關(guān)。向小嬌等[24]研究發(fā)現(xiàn)水稻導(dǎo)入基因pi21，存在對產(chǎn)量的負(fù)效應(yīng)，單獨用來改良水稻品種的稻瘟病抗性，需要與抗性強(qiáng)的主基因聚合，通過多次回交和自交打破該基因與產(chǎn)量的不利連鎖累贅。因此，在對基因選擇聚合育種時，了解抗性材料的基因型背景，從而有針對性的進(jìn)行多基因聚合[25-26]。并不是聚合基因越多越好，而是應(yīng)該選擇抗性好，抗譜互補(bǔ)的基因進(jìn)行聚合。多基因的聚合不僅抗譜拓寬，而且對一些生理小種的抗性也提高，因為多基因的聚合不是簡單地單個抗性基因的抗譜累加，而是抗性基因之間表現(xiàn)為極顯著的基因互作[27]。

本研究中主要利用幾個強(qiáng)致病稻瘟病小種，對80份資源材料進(jìn)行連續(xù)兩年穗頸瘟抗性鑒定，且利用水稻稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54的功能標(biāo)記進(jìn)行基因型分析，并分析不同基因型對穗頸瘟的抗性作用。在80份試驗材料中，2016年接種鑒定有21份材料表現(xiàn)為感病，其都沒有檢測到Pi-ta基因，2017年接種鑒定有36份材料表現(xiàn)為感病，其中有12份檢測到Pi-ta基因，說明2016年抗性基因Pita對江蘇省內(nèi)稻瘟病菌優(yōu)勢小種具有抗病性，2017抗性基因Pi-ta抗病能力在減弱。這是由于稻瘟病生理小種多、變化速度快、致病力差異大等原因，造成抗病材料在種植幾年后，抗性就會逐漸喪失。兩年接種鑒定都表現(xiàn)為高抗的材料有22份，其中基因型為Pi-ta+Pi54有5份，Pi-ta+Pi-b有5份，Pi-b+Pigm有1份，Pi-ta+Pigm有1份，Pi-ta+Pi-b+Pi54有3份，Pi-b+Pi54+Pigm有6份，Pi-ta+Pi54+Pigm有1份。結(jié)果表明，接種鑒定表現(xiàn)為高抗的材料，都是聚合2個及以上的抗病基因，且都含有主效抗病基因Pi-ta或Pigm。兩年接種鑒定都表現(xiàn)為感病的材料有21份，其中基因型為Pi54+Pigm有2份，Pi-b+Pigm有2份，Pi-b+Pi54有6份，Pi-b有2份，Pi54有5份，沒有檢測到4種抗病基因的有4份。含有單個抗病基因的Pi-b和Pi54在抗性鑒定中基本已經(jīng)喪失抗性。因此，應(yīng)該有針對性的選擇多基因進(jìn)行聚合，僅僅聚合Pi54+Pigm、Pi-b+Pigm、Pi-b+Pi54仍表現(xiàn)為感病特征。雖然，單個抗病基因Pi-b和Pi54的抗性較弱，但基因型為Pi-ta+Pi-b+Pi54和Pi-b+Pi54+Pigm，兩年接種抗性中都表現(xiàn)為抗病，一方面，稻瘟病抗性是由多個基因控制，其中主效基因?qū)Φ疚敛〉目剐杂绊懽畲?；另一方面，稻瘟病菌生理小種很多，不同抗性基因?qū)ι硇》N的抗性存在差異。因此，在多基因聚合中，選擇以Pi-ta或Pigm為主效基因，同時聚合Pi-b和Pi54基因，抗譜能夠互補(bǔ)，可以提高抗稻瘟病的持久性。

4 結(jié) 論

從上述研究結(jié)果來看，針對復(fù)雜多變的稻瘟病菌種群結(jié)構(gòu)，利用單一的抗性基因進(jìn)行水稻抗病育種很難具有持久抗性，因此，在以后的水稻抗病育種中，需要引進(jìn)不同的抗性資源，同時挖掘新的抗稻瘟病基因并進(jìn)行多個有效抗病基因的聚合，才可能選育出具有廣譜持久抗性的水稻新品種。