夏清平，孫小彤，袁嘉喆，徐 超，鄧 麗

眼角膜堿燒傷是常見的眼外傷之一，在化學(xué)燒傷中占比最高，通常是由特殊的職業(yè)或行為引起，高致殘率嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］，早期有效的治療對于恢復(fù)視功能和減少并發(fā)癥非常重要。目前臨床針對角膜堿燒傷的早期治療主要以清水或生理鹽水沖洗、激素以及各種修復(fù)功能的滴眼液為主，效果有一定的局限性，如何進(jìn)一步提高治療效果是臨床上迫切需要解決的問題［2］。

臭氧是一種超活性氧，由于其強(qiáng)大的氧化性、氧溶解性和殺菌特性，近年來在臨床上備受重視。研究證實(shí)［3］，臭氧水溶液對兔眼煙曲霉菌性角膜潰瘍具有很好的抗菌治療效果，與氟康唑滴眼液的比較，療效相似且具有天然不耐藥、成本低等優(yōu)勢。肖彩雯等［4］通過體外滅菌實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)了臭氧生理鹽水對真菌性角膜炎的治療效果，并確定了最佳臭氧溶液治療濃度。筆者通過建立大鼠角膜堿燒傷模型，驗(yàn)證臭氧可以減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)并觀察有效的治療濃度，為臨床治療角膜堿燒傷提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 SPF級健康SD雌性大鼠30只（體重250～300 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心動(dòng)物房提供）隨機(jī)分為空白對照組、模型組、低濃度（2 mg/L）臭氧治療組，中濃度（3 mg/L）臭氧治療組，高濃度（4 mg/L）臭氧治療組，每組6只。大鼠堿燒傷模型制備：以4 ml/kg的劑量使用10%水合氯醛溶液腹腔注射大鼠，進(jìn)行麻醉。剪切直徑為3.0 mm的圓形濾紙，在1 mol/L NaOH溶液中浸泡60 s，并用其他濾紙將多余液體吸干后，迅速將其附著于角膜表面中央45 s，隨后快速使用生理鹽水于結(jié)膜囊沖洗70 s。在角膜中央可以看到灰白色的灼燒區(qū)域，呈圓形，大小相同表示建模成功。治療方案：堿燒傷模型組滴眼生理鹽水，3滴/次，3次/d，連續(xù)7 d。將不同濃度的臭氧溶解到滅菌注射用水中，制備成低濃度組（2 mg/L），中濃度組（3 mg/L），高濃度組（4 mg/L），滴眼3次/d，滴注方式同上。治療第7天后，處死大鼠、取材一部分置于EP管中，并儲存于-80℃冰箱中備用（ELISA法測SOD/MDA）。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察 用裂隙燈顯微鏡（SLM2型，重慶康華）分別在堿燒傷后第1、3、7天對大鼠眼角膜觀察角膜溶解 （使用Pfister評分標(biāo)準(zhǔn)）［5］、角膜混濁（Holland評分標(biāo)準(zhǔn)）程度［6］。計(jì)算角膜新生血管長度及面積，公式：S=C/12×3.1416［r2（r-l）2］，C 為角膜血管網(wǎng)所占的圓周數(shù)，l為新生血管的生長長度，r為角膜半徑。

1.3 SOD/MDA的檢測方法 使用SOD/MDA ELISA試劑盒（南京建成生物），使用硫代巴比妥法測定樣本中MDA的含量。SOD試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人超氧化物歧化酶（SOD）水平。具體步驟參照試劑說明書。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行SOD、MDA 數(shù)據(jù)處理。 計(jì)量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析的方法，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臭氧對大鼠眼角膜堿燒傷后的治療作用 臭氧水可以有效降低角膜溶解面積、減輕角膜混濁度、抑制角膜新生血管面積、促進(jìn)角膜恢復(fù)。與模型組相比，臭氧治療組（高、中、低劑量組）術(shù)后7 d與術(shù)后1 d相比角膜溶解面積、角膜混濁度明顯減少，角膜新生血管面積明顯降低，其中，中濃度組（3 mg/L）效果最為明顯（P＜0.01）。 見表 1。

2.2 臭氧對大鼠眼角膜堿燒傷后氧化應(yīng)激的抑制作用 角膜堿燒傷后，與對照組相比MDA含量明顯增加，SOD活力明顯降低（P＜0.05）。經(jīng)過臭氧治療后明顯降低角膜的氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組相比，中劑量治療組明顯降低角膜組織中 MDA的表達(dá)（P＜0.05），增加 SOD 含量的表達(dá)（P＜0.05）。 見表2。

3 討論

人體除眼角膜外，其他部位的氧供大部分來自于呼吸系統(tǒng)，而眼角膜的氧供80%是通過與外界空氣接觸而獲得，15%來自于角膜緣血管，5%來自房水［7］?？諝夂筒€結(jié)膜血管提供的氧通過淚液傳遞給角膜。當(dāng)角膜堿燒傷后，角膜組織恢復(fù)過程中對氧的需求增加，但目前臨床上使用的眼部治療用品，多以抗炎、促修復(fù)為主，缺少直接釋氧、供氧的治療方法。臭氧（O3）由3個(gè)氧原子組成，是氧氣的同素異形體，氧化性更強(qiáng)、水溶性更高，溶解度是普通氧氣的10倍，更易溶于血液和組織液，增加游離氧的含量，提供更充足的氧化作用和氧飽和作用。常溫常壓下，其穩(wěn)定性較差，半衰期僅為30～60 min，可自行分解為氧氣并同時(shí)釋放一些能量，有利于補(bǔ)充細(xì)胞的能量供給，提高細(xì)胞的代謝能力［8，9］。 臭氧溶于水增加了溶解氧的含量，直接作用于組織表面，有利于受損組織細(xì)胞攝取氧、促進(jìn)組織修復(fù)［10］，該實(shí)驗(yàn)通過鏡下觀察角膜組織證實(shí)臭氧水可以有效降低角膜溶解面積、減輕角膜混濁度、抑制角膜新生血管面積，促進(jìn)角膜恢復(fù)。通過對不同治療濃度的比對，筆者發(fā)現(xiàn)中等劑量（3 mg/L）的臭氧水治療效果最好。

表1 不同濃度的臭氧對大鼠角膜堿燒傷后的治療作用

表2 不同濃度臭氧對堿燒傷眼角膜組織中MDA/SOD含量表達(dá)的影響（x±s）

臭氧本身是一種強(qiáng)氧化劑，文獻(xiàn)報(bào)道［11］適當(dāng)?shù)某粞醮碳た梢哉T導(dǎo)體內(nèi)抗氧化反應(yīng)增強(qiáng)，清除過多的氧自由基，降低炎性反應(yīng)，繼而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。其主要機(jī)制［12］是通過增強(qiáng)丙酮酸鹽的氧化羧基化作用，提高細(xì)胞內(nèi)ATP和2，3-DPG水平，激活三羧酸循環(huán)，增加多種氧自由基清除酶的生成，例如谷胱甘肽過氧化氫酶 （GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）等。通過測定SOD活性和MDA的含量證實(shí)了臭氧可以降低角膜堿燒傷后引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，這可能是臭氧促進(jìn)角膜恢復(fù)的機(jī)制的之一。臭氧由于是一種氧化劑，相比傳統(tǒng)的生理鹽水、激素以及各種抗生素藥水而言是一種天然不耐藥的抗生素，具有無依賴性、價(jià)格低廉、使用方便等諸多優(yōu)勢。

由于該實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)初衷是證實(shí)臭氧治療降低氧化應(yīng)激損傷的有效性，因此僅觀察了術(shù)后7 d的角膜恢復(fù)情況，計(jì)劃在以后的實(shí)驗(yàn)中延長觀察時(shí)間或增加組織形態(tài)學(xué)的檢測，以進(jìn)一步證實(shí)結(jié)論。