尹寶英, 張 浩，張文娟

(1.咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，咸陽市動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712000；2.陜西正大有限公司，陜西 咸陽 712000)

豬病毒性腹瀉病是由一種或一種以上病毒感染豬只所引發(fā)的以腹瀉為主的消化道功能障礙性疾病。國內(nèi)研究報(bào)道顯示2010年后引起仔豬腹瀉致死的主要病毒是豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)，該病毒臨床上常與豬傳染性胃腸炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV) 和豬輪狀病毒(porcinerotavirus，PRV)呈混合感染。主要臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、脫水甚至死亡，嚴(yán)重影響仔豬的健康發(fā)展。貴州、安徽省、河北省等規(guī)?；i場的進(jìn)行可疑病原檢測結(jié)果顯示PEDV感染仔豬最為嚴(yán)重，感性強(qiáng)，致死率高，陽性率高達(dá)為63.54%，存在與TGEV和PRV混合感染情況[1～6]。因此，筆者研究對2018年期間陜西部分規(guī)?；i場送檢的162例患有腹瀉的仔豬病料進(jìn)行病原檢測，分析PEDV、TGEV與PRV三種病毒性腹瀉在陜西的流行狀況，以期為該類疾病的防控提供資料依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 病料源自2018年陜西地區(qū)部分規(guī)?；B(yǎng)豬場的仔豬的腸道組織、內(nèi)容物及糞便，共計(jì)162份。發(fā)病仔豬臨床呈現(xiàn)嘔吐，腹瀉，脫水甚至死亡。病理剖檢可見小腸擴(kuò)張，腸腔內(nèi)充滿黃色液體，腸系膜淋巴結(jié)水腫，腸系膜充血。

1.1.2 主要試劑 病毒 RNA/DNA提取試劑盒、總RNA提取液、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、rTaq DNA 聚合酶、dNTP、Oligo( dT) 、RNA酶抑制劑、DNA Marker DL 2000購自寶生物工程( 大連) 有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank序列使用 Premier 5.0 生物軟件設(shè)計(jì)PEDV、TGEV、PRV基因特異性引物序，引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成，詳情見表1。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

組織及排泄物中RNA提取按試劑盒提供的操作手冊，以總 RNA為模板進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件如下：45 ℃ 30 min，94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下成像拍照，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PEDV、TGEV和PRV感染情況統(tǒng)計(jì)

對全年送檢的162例腹瀉仔豬檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，病毒性腹瀉病例共74例，占仔豬腹瀉送檢樣的45.68%。其中PEDV的陽性檢出率最高，達(dá)16.04%，TGEV和PRV的檢出率分別為10.49%和9.87%(表2)。

表2 PEDV、TGEV和PRV陽性檢出率

2.2 不同日齡腹瀉仔豬病毒的感染情況統(tǒng)計(jì)

仔豬日齡不同，PEDV、TGEV和PRV的陽性檢出率也不同(表3)。1～5日齡仔豬，PEDV、TGEV的陽性率在1-10日齡發(fā)病仔豬中檢出率最高，達(dá)70.26%、64%，而PRV的檢出率在10日齡后上升尤其是斷奶后高達(dá)35.71%。

表3 不同日齡PEDV、TGEV和PRV陽性檢出率

2.3 PEDV、TGEV 和PRV 感染的季節(jié)性分布

PEDV、TGEV和PRV全年均被檢出，其中冬季陽性檢出率最高，分別達(dá)到35.13%、36%和39.29%，夏季發(fā)病率最低( 表4) 。

表4 各季節(jié)仔豬腹瀉病毒檢出率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，PEDV、TGEV和PRV是我國豬病毒性腹瀉的主要病原。筆者研究對2018年陜西部分規(guī)模化豬場送檢的疑似患有病毒性腹瀉的樣品進(jìn)行病原檢測。與趙志敏對2015-2016年陜西省腹瀉病料中PEDV和TGEV的檢出率40.33%、9.97%[7]而言，筆者研究檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示2018年P(guān)EDV、TGEV、PRV的陽性檢出率依次為16.04%、10.49% 和9.87%。其中PEDV的檢出率出現(xiàn)明顯降低，可見PEDV的流行有所控制，這也與我國整體養(yǎng)殖業(yè)疫病防控的重視度加大有絕對的關(guān)系。

筆者研究結(jié)果表明，仔豬日齡不同，PEDV、TGEV和PRV的檢出率也不同。PEDV、TGEV的陽性率在1～10日齡發(fā)病仔豬中檢出率最高，達(dá)70.269%、64%，而PRV的檢出率在10日齡后上升尤其是斷奶后，可達(dá)35.71%。這與新生仔豬抵抗力較低，和缺乏相應(yīng)抗體有關(guān)。另外，PEDV、TGEV和PRV三種病毒在不同季節(jié)均有檢出，但不同季度差異較大，在寒冷的冬春兩季明顯高于夏、秋季節(jié)，這一結(jié)果符合這三種病毒的季節(jié)性流行特點(diǎn)。尤其是PEDV在冬季有高達(dá)35.13%的檢出率。這與低溫對于PEDV的變異、感染力增強(qiáng)有關(guān)[8]。所以在氣溫較低的冬春季加強(qiáng)哺乳仔豬的溫濕度等飼養(yǎng)管理至關(guān)重要。

[2] 謝晶,于吉鋒,周瀧,等. 雞傳染性喉氣管炎病毒可視化LAMP快速診斷方法的建立和應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī),2019,46(02);565-572.

[3] 牛家強(qiáng),徐業(yè)芬,胡思順,等. 藏雞雞毒支原體的分離鑒定及對常用抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2018,38(11):2 084-2 093.

[4] 徐懷英,劉星麗,秦卓明. 雞滑液支原體病的防控應(yīng)引起高度重視[J].家禽科學(xué),2019(04):9-14.

[5] 朱小甫,吳旭錦,高睿,等. I群禽腺病毒通用nPCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2018,http://kns.cnki.net/kcms/detail/31.2031.5.20180914.1551.006.html.

[6] 朱小甫,吳旭錦.利用M基因鑒別新城疫病毒中強(qiáng)毒株與弱毒株RT-nPCR方法的建立[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2017,25(05): 21-25.

[7] 朱小甫,楊萍,吳旭錦.H9亞型禽流感病毒DJ15株的分離與鑒定[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,62(05):66-67.