肖亞玲，王雪，孫正怡，甄璟然，郁琦，鄧成艷，周遠(yuǎn)征，王含必

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦科內(nèi)分泌與生殖中心，北京 100730)

隨著近幾年我國二胎政策的放開，越來越多通過體外受精技術(shù)生育過一胎的夫婦再次到生殖中心就診，希望復(fù)蘇前次冷凍的胚胎進(jìn)行移植，于是出現(xiàn)了大量復(fù)蘇長期凍存胚胎的情況。由于胚胎冷凍保存的時間長短不一，其復(fù)蘇后的發(fā)育潛能和隨后的妊娠結(jié)局是否受到冷凍時長的影響這一問題也引起了越來越多患者和醫(yī)務(wù)人員的關(guān)注。冷凍胚胎保存時限的中國專家共識中提出胚胎冷凍保存6年內(nèi)不影響胚胎復(fù)蘇后存活率、著床率、妊娠率、活產(chǎn)率以及子代出生缺陷率，但是尚無足夠證據(jù)證實胚胎冷凍保存時間超過6年對凍融胚胎移植安全性有影響[1]。目前國內(nèi)外冷凍保存6年以上復(fù)蘇移植的大樣本的研究很少，出現(xiàn)的也多為小樣本或個例報道。本研究將探討使用開放系統(tǒng)囊胚玻璃化冷凍保存時長對復(fù)蘇移植妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局的影響，進(jìn)一步探討超過6年的玻璃化冷凍保存是否對胚胎的臨床結(jié)局有影響，從而對今后的臨床工作進(jìn)行指導(dǎo)。

資料和方法

一、研究對象

選取2006年3月至2018年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院婦科內(nèi)分泌與生殖中心進(jìn)行玻璃化冷凍復(fù)蘇囊胚移植的患者，排除各種子宮異常(包括子宮肌瘤、子宮肌腺癥、子宮內(nèi)膜病變及畸形子宮患者)、惡性腫瘤以及取卵年齡40歲以上的患者。最后納入研究2 643例。根據(jù)囊胚冷凍保存時長將其患者資料分為7組：≤1年，1～2年，2～3年，3～4年，4～5年，5～6年和≥6年。

二、研究方法

1.促排卵及囊胚培養(yǎng)：所有患者采用激動劑降調(diào)方案或拮抗劑方案促排卵，通過陰道B超引導(dǎo)下進(jìn)行穿刺取卵，根據(jù)患者情況進(jìn)行IVF或ICSI授精操作。取卵24 h后判斷受精情況，第3天評估卵裂期質(zhì)量并移植，剩余全部胚胎均經(jīng)患者知情同意后進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，第5天和第6天分別觀察囊胚形成情況，采用Gardner評分法進(jìn)行囊胚評分[2]，并將囊胚擴(kuò)張到4期、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)級別為B級及以上的囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍保存。其中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞級別均在B級及以上級別的為優(yōu)質(zhì)胚胎。所有胚胎在37℃、5% O2、6%CO2的條件下培養(yǎng)。

2.玻璃化冷凍：冷凍之前使用激光對囊胚進(jìn)行人工皺縮，待胚胎皺縮良好再進(jìn)行冷凍。冷凍液分為3個濃度梯度，1號冷凍液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)，胚胎在此液體中平衡1～2 min。2號冷凍液為含有7.5%(v/v)二甲基亞砜和7.5%(v/v)乙二醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，胚胎在此液體中平衡2 min，并多次輕柔吹吸。3號冷凍液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)添加了15%(v/v)二甲基亞砜+15%(v/v)乙二醇+0.65 mol/L蔗糖+10 mg/ml聚蔗糖Ficoll，將胚胎在此液體中反復(fù)吹吸混勻至少20次，之后轉(zhuǎn)移到冷凍載桿并投入液氮，3號液體操作時間為25～30 s。所有操作均在37℃工作臺上進(jìn)行。

3.囊胚復(fù)蘇：囊胚復(fù)蘇于移植當(dāng)天進(jìn)行。復(fù)蘇液也分為3個濃度梯度，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)，1號復(fù)蘇液添加0.33 mol/L的蔗糖，胚胎在此液體中停留2 min。2號復(fù)蘇液為有0.2 mol/L的蔗糖溶液，胚胎在此液體中停留3 min。3號復(fù)蘇液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，胚胎在此液體中停留5 min并用激光在遠(yuǎn)離細(xì)胞團(tuán)的透明帶上切割約1/4進(jìn)行輔助孵化，之后轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中放入三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后移植。復(fù)蘇操作均在37℃工作臺上進(jìn)行。

4.內(nèi)膜準(zhǔn)備及胚胎移植：患者內(nèi)膜準(zhǔn)備如之前文獻(xiàn)所述[3]，分為兩種方法。第一種為自然周期，在B超監(jiān)測排卵前注射HCG(艾澤，默克雪蘭諾，德國)，監(jiān)測到卵泡破裂后第6天進(jìn)行復(fù)蘇移植，根據(jù)激素測定值必要時肌肉注射HCG。第二種方法為人工周期法，在月經(jīng)第2～4天常規(guī)B超檢查，口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，先靈，德國)，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm時肌肉注射黃體酮(20 mg/支，浙江仙琚制藥)轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，肌肉注射黃體酮后第6天進(jìn)行復(fù)蘇移植，移植后肌肉注射黃體酮進(jìn)行黃體支持。

三、觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

比較各組患者一般情況(取卵年齡、移植年齡、平均移植胚胎數(shù)、囊胚冷凍前優(yōu)質(zhì)胚胎率和冷凍時D5胚胎比例)，臨床結(jié)局(復(fù)蘇存活率、種植率、妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、活產(chǎn)率)，活產(chǎn)出生結(jié)局(單胎率、出生男孩率、出生缺陷發(fā)生率)和單胎新生兒出生結(jié)局(出生體重、身長、孕天數(shù))之間的差異；使用二分類Logistic回歸分析對相關(guān)參數(shù)對臨床妊娠率和活產(chǎn)率的影響進(jìn)行分析。

種植率：B超下見到妊娠囊總數(shù)占移植胚胎總數(shù)的百分比；妊娠率：移植4周后B超下見到妊娠囊總例數(shù)與移植周期總例數(shù)的百分比；活產(chǎn)率：隨訪獲得活產(chǎn)的總例數(shù)與移植周期總例數(shù)的百分比；流產(chǎn)率：在臨床妊娠過程中流產(chǎn)的例數(shù)占臨床妊娠總例數(shù)的百分比；異位妊娠率：發(fā)生異位妊娠的總例數(shù)占臨床妊娠總例數(shù)的百分比；單胎率：單胎出生的總例數(shù)占活產(chǎn)例數(shù)的百分比；出生缺陷發(fā)生率：出生缺陷發(fā)生的總例數(shù)占活產(chǎn)例數(shù)的百分比。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

使用spss21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)變量采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差分析進(jìn)行組間比較；分類變量用率(%)來表示，用卡方檢驗(χ2)或Fisher精確檢驗進(jìn)行組間比較。并采用二分類Logistic回歸分析，以取卵年齡、移植年齡、胚胎冷凍保存時間、胚胎級別和囊胚發(fā)育速度為自變量，妊娠率和活產(chǎn)率為因變量，對妊娠率和活產(chǎn)率的影響進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者總體情況

本研究一共收集了2 650例囊胚冷凍復(fù)蘇周期資料，其中7例因復(fù)蘇后胚胎質(zhì)量差或內(nèi)膜等問題取消移植，復(fù)蘇后取消率為0.26%，最終移植2 643例，胚胎冷凍保存時間最長為11.77年。

取卵年齡20.36～40.00歲，平均年齡(32.35±3.90)歲，移植年齡21.04～45.08歲，平均年齡(33.43±3.96)歲。復(fù)蘇胚胎總數(shù)為4 739枚，其中復(fù)蘇后存活4 689枚，復(fù)蘇存活率為98.94%。移植胚胎總數(shù)為4 675枚，種植率為42.78%(2 000/4 675)，妊娠率為56.11%(1 483/2 643)，流產(chǎn)率為13.69%(203/1 483)，異位妊娠率為1.08%(16/1 483)，活產(chǎn)率為47.22%(1 248/2 643)，出生缺陷發(fā)生率為0.72%(9/1 248)。

二、患者一般情況比較

各組周期數(shù)、取卵年齡、移植年齡、平均移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎率和移植D5胚胎率表1所示。單因素方差分析結(jié)果顯示取卵年齡、移植年齡和優(yōu)質(zhì)胚胎比例各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，≥6年組的取卵年齡顯著小于其他組，而移植年齡顯著大于其他組，優(yōu)質(zhì)胚胎率也高于其他組。各組平均移植胚胎數(shù)和D5胚胎比例無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組患者一般情況比較[(-±s)，%]

三、冷凍復(fù)蘇移植臨床結(jié)局比較

各組臨床結(jié)局結(jié)果補(bǔ)充：≤1年組有3例妊娠結(jié)局失訪，1～2年組1例妊娠結(jié)局失訪，1例死產(chǎn)，3～4年組有3例妊娠結(jié)局失訪，4～5年組有3例妊娠結(jié)局失訪，5～6年組有3例妊娠結(jié)局失訪，失訪率為0.49%?？ǚ綑z驗結(jié)果顯示復(fù)蘇胚胎存活率、妊娠率和活產(chǎn)率各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中1～2年組的存活率、妊娠率和活產(chǎn)率均最低，分別為97.19%、48.87%和39.27%，而≥6年組的復(fù)蘇胚胎存活率、妊娠率和活產(chǎn)率均高于總的存活率、妊娠率和活產(chǎn)率。各組種植率、流產(chǎn)率、異位妊娠率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組冷凍復(fù)蘇移植臨床結(jié)局比較(%)

經(jīng)過Logistic回歸對影響妊娠率的因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示取卵年齡、移植年齡和冷凍保存的時長對妊娠率沒有顯著影響(P>0.05)。而移植D5胚胎比例和優(yōu)質(zhì)胚胎的個數(shù)對妊娠率有影響，移植全部不為D5(移植全為D6)胚胎相對于移植全部為D5胚胎的妊娠率降低[OR=0.606，95%CI(0.511，0.720)，P=0.000]；移植1個優(yōu)質(zhì)胚胎(包括只移植1個優(yōu)質(zhì)胚胎、移植1個優(yōu)質(zhì)胚胎和1個非優(yōu)質(zhì)胚胎、移植1個優(yōu)質(zhì)胚胎和2個非優(yōu)質(zhì)胚胎三種情況)和2個優(yōu)質(zhì)胚胎(包括只移植2個優(yōu)質(zhì)胚胎、移植2個優(yōu)質(zhì)胚胎和1個非優(yōu)質(zhì)胚胎兩種情況)相對于移植0個優(yōu)質(zhì)胚胎妊娠率增加(P=0.000)(表3)。

表3 影響妊娠率因素的Logistic回歸分析結(jié)果

經(jīng)過Logistic回歸對影響活產(chǎn)率的因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示取卵年齡和冷凍保存時長對活產(chǎn)率沒有顯著影響(P>0.05)。而移植年齡對活產(chǎn)率有影響，移植年齡的增加會降低活產(chǎn)率[OR=0.976，95%CI(0.956，0.996)，P<0.05]。同樣的移植D5胚胎比例和優(yōu)質(zhì)胚胎的個數(shù)對活產(chǎn)率有影響，移植全部不為D5(移植全為D6)胚胎相對于移植全部為D5胚胎的活產(chǎn)率降低(P=0.000)，移植1個優(yōu)質(zhì)胚胎和2個優(yōu)質(zhì)胚胎相對于移植0個優(yōu)質(zhì)胚胎活產(chǎn)率增加(P=0.000)(表4)。

四、活產(chǎn)情況比較

各組活產(chǎn)情況比較結(jié)果：≥6年組活產(chǎn)24例，單胎率[75%(18/24)]高于其他組，出生男孩比例[60%(18/30)]高于其他組，出生缺陷發(fā)生率為0，低于或等于其他組。經(jīng)卡方檢驗，各組活產(chǎn)的單胎率、出生男孩比例和出生缺陷發(fā)生率均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表5)。

五、單胎新生兒出生結(jié)局比較

各組單胎新生兒出生結(jié)局：≥6年組單胎18例，單胎出生體重(3 348.33±480.89)g，單胎身長(50.00±1.91)cm，孕天數(shù)為(267.72±13.84)d；經(jīng)單因素方差分析，各組的單胎出生體重，單胎身長和孕天數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表6)。

表4 影響活產(chǎn)率因素的Logistic回歸結(jié)果

表5 各組冷凍復(fù)蘇移植活產(chǎn)情況比較(%)

表6 各組冷凍復(fù)蘇移植單胎新生兒出生結(jié)局比較(-±s)

討 論

胚胎冷凍保存技術(shù)是輔助生殖技術(shù)最重要的衍生技術(shù)。大部分IVF周期在新鮮移植后都會剩余胚胎，有的患者因子宮或其他疾病不能進(jìn)行新鮮周期移植，此時便需要將胚胎冷凍保存或者將胚胎培養(yǎng)至囊胚階段并冷凍保存。胚胎冷凍保存有利于提高單個取卵周期的胚胎利用率和累積妊娠率，減少胚胎移植數(shù)量，降低多胎的發(fā)生率，降低患者的治療費用，避免了新鮮周期移植可能會出現(xiàn)的卵巢過度刺激綜合征。而且對于因子宮肌瘤、內(nèi)膜病變等病情需要的患者，需要冷凍保存胚胎后，經(jīng)過治療婦科疾病后再進(jìn)行移植[1]。囊胚培養(yǎng)雖然會減少可用胚胎的數(shù)量，但是一定程度上可以淘汰掉染色體異常等質(zhì)量差的胚胎，進(jìn)一步篩選出發(fā)育潛能好的胚胎[4]。所以囊胚冷凍復(fù)蘇移植有重要的臨床應(yīng)用價值。

根據(jù)理論模型，哺乳動物配子和胚胎可以冷凍儲存幾千年依舊保持生命力[5]。一項大型隊列研究結(jié)果表明，使用封閉的玻璃化冷凍載體冷凍保存胚胎的時長對存活、植入、活產(chǎn)、新生兒結(jié)局和先天畸形沒有明顯的負(fù)面影響[6]，但是，目前有很多實驗室使用開放的冷凍載體多過封閉載體[7]。之前有研究稱，當(dāng)使用開放冷凍系統(tǒng)保存卵母細(xì)胞時，保存的時長對臨床結(jié)果沒有明顯的負(fù)面影響，但是沒有明確對新生兒結(jié)局的影響[8]。還有研究探討了使用開放系統(tǒng)玻璃化冷凍保存時長對卵裂期胚胎的影響，結(jié)果顯示保存時間5年內(nèi)不影響胚胎存活率和妊娠結(jié)局[9]。最近的一項大型隊列研究報告結(jié)果顯示，使用開放系統(tǒng)長期保存囊胚對妊娠和新生兒結(jié)局沒有明顯負(fù)面影響，但是該研究的局限性在于最大儲存期為8年，而且并未將≥6年的資料單獨列出[10]。本研究旨在探討使用開放冷凍保存系統(tǒng)情況下，囊胚玻璃化冷凍保存時長對復(fù)蘇移植妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局的影響，進(jìn)一步探討超過6年的玻璃化冷凍保存是否對胚胎的臨床結(jié)局有影響。

有研究表明冷凍復(fù)蘇細(xì)胞的存活率隨著低溫儲存時間的延長而下降[11]。本研究結(jié)果顯示，保存時間1～2年組的存活率最低，為97.19%，而5～6年組和≥6年組的存活率都為100%，說明冷凍復(fù)蘇胚胎的存活率并不會隨著儲存時間的延長而下降；雖然1～2年組的優(yōu)胚率不是最低，但是還是稍稍低于總體優(yōu)胚率，所以各組冷凍復(fù)蘇胚胎的存活率可能與胚胎的質(zhì)量或者其他因素有關(guān)系。但由于本中心絕大多數(shù)冷凍方式是兩個胚胎冷凍在一個載桿內(nèi)，而且復(fù)蘇后的培養(yǎng)也為集合培養(yǎng)，無法準(zhǔn)確地追蹤不同胚胎的復(fù)蘇存活情況，所以無法進(jìn)一步分析影響胚胎復(fù)蘇存活率的因素。收集更多單胚胎冷凍復(fù)蘇移植的資料，并分析其復(fù)蘇存活率的影響因素是我們今后的研究方向。

本研究中各組臨床妊娠率和活產(chǎn)率在不同冷凍保存時間組有差異，由于患者基礎(chǔ)情況中取卵年齡、移植年齡和移植優(yōu)胚率都有差異，所以并不能判斷是否是玻璃化冷凍保存時長的差別導(dǎo)致了各組妊娠率和活產(chǎn)率的差異。于是進(jìn)一步使用二分類Logistic回歸分析影響妊娠率和活產(chǎn)率的因素。結(jié)果顯示，取卵年齡、移植年齡和冷凍保存時長對妊娠率沒有顯著影響，而增加移植D5胚胎和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量可以提高妊娠率，與以往研究D5凍融囊胚的臨床妊娠率顯著高于D6凍融囊胚臨床妊娠率[12]的結(jié)論一致。取卵年齡、冷凍保存時長對活產(chǎn)率沒有顯著影響，而降低移植年齡、增加移植D5胚胎和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)量可以提高活產(chǎn)率，與以往研究中活產(chǎn)率與囊胚冷凍日期(D5或D6)有關(guān)而與冷凍保存時間長短無關(guān)的結(jié)論一致[10]。但是在其他研究中囊胚直徑[10，13]、既往胚胎移植次數(shù)[10，14]已經(jīng)被證明與胚胎移植后的活產(chǎn)有關(guān)。在本研究中這些數(shù)據(jù)因資料的缺失并沒有提供，今后可以收集這方面資料，完善研究。對于≥6年組的資料，其優(yōu)胚率(84.42%)遠(yuǎn)高于總體優(yōu)胚率(69.56%)，所以臨床妊娠率(59.10%)和活產(chǎn)率(54.55%)均高于總體臨床妊娠率(56.11%)和活產(chǎn)率(47.22%)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)使用開放性載體玻璃化冷凍保存囊胚的時長對新生兒結(jié)局沒有負(fù)面影響。各凍存時長組間出生缺陷率、單胎出生體重、出生身長和孕天數(shù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而且≥6年組的出生缺陷發(fā)生率低于其他各組。以往的研究中報道過胚胎冷凍保存會增加孕周增長的風(fēng)險，可能與表觀遺傳修飾和胚胎培養(yǎng)環(huán)境的變化有關(guān)[15]，但是本研究結(jié)果表明，各組之間的孕天數(shù)并沒有明顯的差異，冷凍保存時長的延長并沒有增加孕天數(shù)，≥6年組的孕天數(shù)(267.72±13.84)d，甚至略低于其他各組。

玻璃化冷凍與程序冷凍相比，需要設(shè)備少，節(jié)省人力，胚胎復(fù)蘇存活率高[16]，越來越多的生殖中心使用這種方法冷凍胚胎。但是由于玻璃化冷凍采用的冷凍保護(hù)劑濃度高，一直以來都有對于安全性的顧慮。雖然國內(nèi)外還未有玻璃化冷凍復(fù)蘇周期出生缺陷增多的報道[17]，但是動物研究表明，玻璃化會影響基因的表達(dá)和表觀遺傳狀態(tài)，包括在牛和小鼠玻璃化囊胚中降低啟動子甲基化[18-19]。所以對玻璃化冷凍復(fù)蘇周期出生胎兒進(jìn)行長期隨訪，從而進(jìn)一步研究其安全性是今后研究的方向。

在實際工作中，還有很多因素可能會影響到冷凍胚胎的復(fù)蘇結(jié)果，例如冷凍保存過程中反復(fù)打開液氮儲存罐、冷凍載體的更新?lián)Q代、冷凍復(fù)蘇操作程序的改進(jìn)等等。本研究都沒有排除這些因素對結(jié)果的影響。本研究的另一個局限是其回顧性，可能會增加患者選擇的偏倚。

綜上所述，基于目前我們的研究，使用開放性載體玻璃化冷凍保存囊胚的時長對復(fù)蘇后移植的妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局沒有明顯影響。囊胚冷凍日期和囊胚質(zhì)量才是影響臨床結(jié)局的因素。囊胚經(jīng)過玻璃化冷凍并進(jìn)行6年以上長期冷凍保存，臨床結(jié)局未產(chǎn)生明顯負(fù)面影響。