徐聶 白云丹 羅婷 段萍

軟組織肉瘤（soft tissue sarcoma）大多來源于間充質(zhì)干細(xì)胞，約占成人惡性腫瘤的1%，兒童惡性腫瘤的15%［1］，惡性程度高，放化療療效差，治療難度大，臨床尚缺乏有效治療軟組織肉瘤的藥物。因此，尋找新的治療軟組織肉瘤的藥物尤為重要。

大量的研究已經(jīng)證實(shí)新生血管是多種實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)、繁殖的關(guān)鍵因素。抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可抑制血管生成，阻止腫瘤生長(zhǎng)。通過藥物使腫瘤血管正?；?］，改造腫瘤微環(huán)境，而不直接殺滅腫瘤細(xì)胞是目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

目前，臨床上抑制腫瘤血管生成的藥物并不少見，如貝伐珠單抗、重組人血管內(nèi)皮抑制素（恩度）等，但上述藥物價(jià)格昂貴，因此亟需經(jīng)濟(jì)且有效的抗血管生成藥物。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的長(zhǎng)春新堿、環(huán)磷酰胺和紫杉醇等藥物均具有抑制血管生成的活性。其中紫杉醇在不同濃度下，表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性，臨床上常常依靠紫杉醇的細(xì)胞毒作用來殺死腫瘤細(xì)胞。低劑量的紫杉醇對(duì)腫瘤血管有抑制作用，卻無細(xì)胞毒作用。研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇劑量在20～28 mg/kg時(shí)，在同源小鼠模型中表現(xiàn)出抗血管活性［3-4］，其作用機(jī)理主要為抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)及排列，減少VEGF誘導(dǎo)的新生血管系統(tǒng)的生成［5］。沙利度胺［6-7］已被發(fā)現(xiàn)在免疫、抗炎、抗血管生成方面有較好的療效，臨床應(yīng)用于胃腸道、呼吸系統(tǒng)疾病，在多種實(shí)體瘤中也被證實(shí)有抗血管生成作用，但在軟組織肉瘤方面的報(bào)道卻較為少見。左立杰等［8］對(duì)12例Ⅳ期軟組織肉瘤患者，給予依托泊苷聯(lián)合沙利度胺治療，疾病控制率（disease control rate，DCR）為50%，中位無進(jìn)展生存期（median progression free survival，mPFS）為4.4個(gè)月。

臨床治療中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用紫杉醇或沙利度胺，療效并不理想，極易產(chǎn)生耐藥。因此，尋找最佳的藥物組合方案具有重要的臨床意義。韋華軍等［9］聯(lián)合沙利度胺、紫杉醇和順鉑治療晚期非小細(xì)胞肺癌，聯(lián)合組DCR為85.71%，明顯高于對(duì)照組（64.29%）；聯(lián)合組無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）、總生存期（overall survival，OS）均明顯長(zhǎng)于對(duì)照組。但目前并無紫杉醇聯(lián)合沙利度胺治療軟組織肉瘤的報(bào)道，本研究首次探究低劑量紫杉醇聯(lián)合沙利度胺對(duì)軟組織肉瘤在抗血管方面的作用，確定兩者是否在抑制血管生成方面具有協(xié)同作用，探索其聯(lián)合治療的療效，旨在為治療軟組織肉瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20±2 g，雌雄各50%（購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK（川）2014-189）。S-180 肉瘤細(xì)胞（購(gòu)于上海文樂生物科技有限公司）；紫杉醇注射液（購(gòu)于四川太極制藥有限公司，批號(hào)：11110040，規(guī)格：30 mg）；沙利度胺片（購(gòu)于常州制藥廠，批號(hào)：12082731，規(guī)格：25 mg）；兔抗鼠MVD抗體、兔抗鼠VEGF抗體（購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：E10J015、E10J013）。

1.1.2 儀器 Motic BA400顯微攝像系統(tǒng)（購(gòu)于麥克奧迪公司）；Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics，Inc公司）；倒置相差顯微鏡（購(gòu)于日本OLYMPUS公司）；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（購(gòu)于常州中威醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠移植S-180 肉瘤模型的建立 體外培養(yǎng)S-180 肉瘤細(xì)胞：將S-180 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%小牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中。每日觀察肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，每日更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)3～4代后收集細(xì)胞，通過離心、洗滌、稀釋等方法得到5～6×107cells/mL 左右的稀釋液。對(duì)6～8周齡小鼠腹腔內(nèi)注射上述細(xì)胞懸液0.4 mL，觀察接種小鼠的腹水生長(zhǎng)情況，瘤源鼠制備成功。無菌條件下抽出腹水，1:3 生理鹽水稀釋，充分混勻，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，并計(jì)算活細(xì)胞數(shù)＞95%，將上一步所得的懸液0.2 mL 注射至小鼠前肢右腋皮下，接種7天左右形成皮下荷瘤。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將接種的BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分成4組（每組10只），分別為生理鹽水組（對(duì)照組）、紫杉醇組、沙利度胺組和紫杉醇+沙利度胺組（聯(lián)合組）。生理鹽水組：0.2 mL腹腔注射，每周3次，連續(xù)2周。紫杉醇組：20 mg/kg腹腔注射，每周3次，連續(xù)2周。沙利度胺組：200 mg/kg灌胃，每周3次，連續(xù)2周。聯(lián)合組：紫杉醇20 mg/kg腹腔注射，每周3次，連續(xù)2周；沙利度胺200 mg/kg灌胃，每周3次，連續(xù)2周。

1.2.3 一般狀況觀察 實(shí)驗(yàn)期間每日觀察小鼠成瘤情況、皮毛顏色、精神狀態(tài)、活動(dòng)能力、反應(yīng)靈敏度等。7 天后處死形成腫瘤的小鼠，剝離腫瘤組織，測(cè)量瘤體重量。抑瘤率［10］（%）=（對(duì)照組平均重量-治療組平均重量）/對(duì)照組平均質(zhì)量×100%。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤組織VEGF表達(dá)和微血管密度（microvessel density，MVD） 取出皮下種植瘤，先后用10%甲醛固定組織，經(jīng)過脫水、石蠟包埋后制成4 μm厚的連續(xù)切片，供組織病理檢查。用3%過氧化氫室溫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，使用抗原熱修復(fù)，分別滴加一抗在4℃溫度下過夜，再恢復(fù)至室溫。滴加二抗，DAB 染色液顯色，每步之間均用PBS 溶液清洗切片3次。經(jīng)蘇木精復(fù)染細(xì)胞核、不同梯度濃度酒精脫水、二甲苯透明等步驟后，最終用中性樹膠封片。

1.2.5 結(jié)果判定 1）VEGF 結(jié)果判定：以細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。輸入組織切片圖像至計(jì)算機(jī)，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)不重疊視野，應(yīng)用彩色病理圖文分析系統(tǒng)記錄積分光密度值（IOD）；2）MVD 計(jì)數(shù)：采用Weidner 法［11］，400 倍光鏡視野下，計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)微血管數(shù)目，取平均值作為MVD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)以表示，組間采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植瘤生成情況及成瘤率

生理鹽水組腫瘤體積及重量最大，與生理鹽水組比較，其余各組小鼠腫瘤均有明顯減?。≒＜0.01）。與對(duì)照組比較，紫杉醇組、沙利度胺組、聯(lián)合組抑瘤率均升高，其中聯(lián)合組抑瘤率最大（圖1，表1）。

2.2 荷瘤鼠腫瘤組織VEGF的表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，紫杉醇組、沙利度胺組、聯(lián)合組VEGF的表達(dá)強(qiáng)度均降低，且聯(lián)合組與紫杉醇組、聯(lián)合組與沙利度胺組組間比較，均是聯(lián)合組表達(dá)強(qiáng)度更低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表2，圖2）。

圖1 各組小鼠移植瘤生長(zhǎng)情況

表1 各組小鼠抑瘤率的比較

圖2 各組小鼠腫瘤組織VEGF的表達(dá)情況（H＆E×200）

表2 各組小鼠腫瘤組織VEGF的表達(dá)情況

2.3 荷瘤鼠腫瘤組織MVD的計(jì)數(shù)情況

與對(duì)照組比較，紫杉醇組、沙利度胺組、聯(lián)合組MVD計(jì)數(shù)均降低，且聯(lián)合組與紫杉醇組、聯(lián)合組與沙利度胺組組間比較，聯(lián)合組MVD計(jì)數(shù)更低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表3，圖3）。

圖3 各組小鼠腫瘤組織MVD的計(jì)數(shù)情況（H＆E×200）

表3 各組小鼠腫瘤組織MVD的計(jì)數(shù)情況

3 討論

傳統(tǒng)的化療藥物多為細(xì)胞毒藥物，其療效與劑量大小相關(guān)，劑量越大其毒副反應(yīng)明顯增加。目前，發(fā)現(xiàn)不少細(xì)胞毒化療藥物在低劑量時(shí)可抑制血管生成，如長(zhǎng)春新堿在低濃度時(shí)可顯示出抗血管活性；環(huán)磷酰胺在10 μg/mL濃度時(shí)可以促使血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［12］。研究發(fā)現(xiàn)，除了腫瘤內(nèi)生長(zhǎng)的血管外，腫瘤周圍還有很多不規(guī)則的血管環(huán)繞，藥物進(jìn)入腫瘤內(nèi)部后，僅能抑制腫瘤內(nèi)的血管生成，向腫瘤周圍的異常血管滲透能力減弱，導(dǎo)致治療效果不佳?？梢?，腫瘤內(nèi)外血管共同組成的微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起到較為重要的作用，一定程度上導(dǎo)致了耐藥［13］。因此，關(guān)注腫瘤血管正常化，研究傳統(tǒng)化療藥物在抗血管生成方面的作用，能降低臨床上化療藥物使用劑量，有利于減輕化療導(dǎo)致的不良反應(yīng)，而且能探索新的研究方向，因此具有重要的臨床價(jià)值。

紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取出來的半合成衍生物，已發(fā)現(xiàn)具有多種藥理學(xué)特性，如阻止微管聚集［14］、影響細(xì)胞周期［15］、誘導(dǎo)細(xì)胞吞噬及凋亡。上述特性通常被認(rèn)為是通過細(xì)胞毒作用來抑制腫瘤。臨床上紫杉醇聯(lián)合化療多采用的是人體最大耐受劑量135～175 mg/m2。可研究中發(fā)現(xiàn)，紫杉醇在10-7～10-9M 濃度內(nèi)可以減少內(nèi)皮細(xì)胞遷移［16］。徐繪等［17］發(fā)現(xiàn)周期性的給予小劑量的紫杉醇能夠抑制肺癌細(xì)胞株，并可以通過調(diào)節(jié)VEGF-A、TSP-1 等基因影響腫瘤血管生成。在體外內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中［18］，紫杉醇脂質(zhì)體（0.5～10 μmol/L）能有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移。綜上所述，小劑量紫杉醇具有抗血管生成的作用。

沙利度胺（反應(yīng)停）因其導(dǎo)致胎兒畸形而被禁止使用，深入研究發(fā)現(xiàn)其致畸的原因與抗血管生成有關(guān)，其機(jī)制可能為［19］抑制NF-κB 的活化，從而調(diào)節(jié)VEGF 及成纖維因子的分泌。但其在腫瘤與胚胎中對(duì)血管生成中的作用卻不相同［20］。動(dòng)物模型中［21］發(fā)現(xiàn)，沙利度胺能降低肉芽組織中的MVD，VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）表達(dá)水平也明顯降低，還能減少兔角膜中堿性成纖維細(xì)胞的表達(dá)。Eder等［22］研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可以使胃腸道血管中VEGF表達(dá)降低，抑制血管形成，也能降低重度腸出血患者中VEGF 的水平［23］。Salemi 等［24］使用沙利度胺聯(lián)合姜黃素處理急性髓系白血病細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在KG-1 和U937 細(xì)胞系中，兩者能協(xié)同抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)。鑒于沙利度胺的抗血管作用，臨床上逐漸將其應(yīng)用于多種實(shí)體腫瘤的治療，如肝癌、肺癌、軟組織肉瘤。Chen 等［25］對(duì)53 例晚期肝癌患者，給予沙利度胺（口服）2月以上，DCR 為28.3%，OS 為10.5 個(gè)月，1年OS率為45%；16例患者血清AFP水平下降，其下降幅度超過50%。蔡銘泉等［26］在二線化療失敗的22例晚期軟組織肉瘤患者中，給予沙利度胺，初始劑量100 mg/d，1周后增加至200 mg/d，維持治療至疾病進(jìn)展，每2個(gè)月評(píng)價(jià)療效，結(jié)果DCR 為27.3%，mPFS 為1 個(gè)月，中位OS（median OS,mOS）為5 個(gè)月?？梢妴斡蒙忱劝返呐R床療效并不理想。因此，為了提高療效，本研究選擇紫杉醇聯(lián)合沙利度胺一種新的藥物組合方案治療軟組織肉瘤。

本研究采用小鼠軟組織肉瘤移植模型來觀察低劑量紫杉醇和沙利度胺的聯(lián)合抗腫瘤作用。發(fā)現(xiàn)低劑量紫杉醇和沙利度胺均可明顯抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，但聯(lián)合組腫瘤體積最小。與對(duì)照組比較，紫杉醇組、沙利度胺組、聯(lián)合組EGFR的表達(dá)強(qiáng)度、MVD計(jì)數(shù)均降低（P＜0.05），說明低劑量紫杉醇和沙利度胺不僅能抑制腫瘤增殖，而且能減少腫瘤內(nèi)血管的生成。同時(shí)，聯(lián)合組分別與紫杉醇組、沙利度胺組比較，EGFR的表達(dá)和MVD計(jì)數(shù)均降低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明紫杉醇聯(lián)合沙利度胺在抗血管生成方面有協(xié)同效應(yīng)，優(yōu)于單獨(dú)使用。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了低劑量紫杉醇聯(lián)合沙利度胺對(duì)小鼠肉瘤生長(zhǎng)有抑制作用，二者具有協(xié)同作用，為抗肉瘤血管生成提出了新的理論方向。未來研究方向可能是讓腫瘤內(nèi)血管失去病理特征，使血管正?；?，改善腫瘤微環(huán)境，從而提高腫瘤內(nèi)的藥物濃度，提高抗腫瘤治療療效。本研究通過對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的初步探索，為進(jìn)一步的臨床研究提供了依據(jù)，仍需繼續(xù)尋找抗血管生成的最佳濃度及作用機(jī)制，探討抗血管藥物與靶向治療，并與免疫治療相結(jié)合。但是人肉瘤組織分型較多，具有不同的生物學(xué)行為，本研究選用小鼠肉瘤細(xì)胞，尚無法準(zhǔn)確判斷紫杉醇和沙利度胺對(duì)肉瘤不同亞型的影響，亟需進(jìn)一步研究。

希望未來能將紫杉醇和沙利度胺聯(lián)合應(yīng)用于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療產(chǎn)生耐藥且血管豐富的軟組織肉瘤，從而為患者帶來生存獲益。如何確定該方案的臨床有效性和安全性，仍需大樣本的臨床研究來評(píng)估。