嚴黎 劉琬菁 楊成民 張建紅 陳泓宇 羅紅梅

摘要?目的：為了驗證丹參類黃酮-3′，5′-羥基化酶（Flavonoid 3′，5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H）基因與丹參花色表型的相關性，本研究克隆并分析了紫花丹參99-3株系和一些白花丹參中的F3′5′H基因。方法：本研究通過提取紫花丹參和白花丹參中的總RNA，再將其反轉錄得到cDNA，以此cDNA為模板，利用PCR方法擴增獲得F3′5′H基因全長序列。再利用生物信息學分析方法，分析了該基因編碼蛋白質的理化性狀、結構域、系統(tǒng)進化等特點，并預測了該蛋白質的亞細胞定位、跨膜區(qū)等;利用實時定量PCR方法檢測了該基因的表達特異性;利用毛狀根遺傳轉化方法獲得了該基因的過表達陽性毛狀根株系。結果：F3′5′H基因全長1 551 bp，編碼516個氨基酸，相對分子質量為57.4 kDa。該基因在丹參花中高豐度表達。在42份（紫花25份;白花17份）丹參樣品中發(fā)現(xiàn)一個單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）位點在紫花和白花丹參中呈現(xiàn)與花色相關的穩(wěn)定變化。系統(tǒng)發(fā)育分析表明丹參F3′5′H與美女櫻的F3′5′H具有較高序列同源性。獲得了過表達F3′5′H的毛狀根株系。結論：本研究在丹參中克隆到F3′5′H基因，對其序列進行了分析，為進一步研究丹參F3′5′H基因的功能奠定基礎。

關鍵詞?丹參;類黃酮-3′，5′-羥基化酶;基因克隆;表達分析;生物信息學分析;SNP位點分析;丹參花色;轉基因毛狀根

Cloning and Expression Analysis of F3′5′H from Salvia Miltiorrhiza

YAN Li， LIU Wanjing， YANG Chengmin， ZHANG Jianhong， CHEN Hongyu， LUO Hongmei

（Key Lab of Chinese Medicine Resources Conservation， National Administration of Traditional Chinese Medicine of the People′s Republic of China， Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education， Institute of Medicinal Plant Development， Peking Union Medical College， Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract?Objective：To verify the correlation between the Salvia miltiorrhizaF3′5′H （SmF3′5′H） and the phenotype of S.miltiorrhiza flower.This study cloned and analyzed the F3′5′H genes from S.miltiorrhiza 99-3 with purple flowers and some S.miltiorrhiza plants with white flowers.Methods：The total RNA was extracted from S.miltiorrhiza with purple flowers and some S.miltiorrhiza with white flowers.And it was reversed and transcribed into cDNA.Using this cDNA as a template， the full-length of F3′5′H gene order was obtained by PCR method.Bioinformatics analysis was used to analyze the characteristics of physicochemical properties， domains， system evolution and other characteristics.The subcellular localization and transmembrane region etc.of the protein were also predicted.The gene expression features of the genes were detected by real-time quantitative PCR.The transgenic hairy roots of genes were obtained by hairy root genetic transformation method.Results：The length of F3′5′H was 1551 bp， encoding 516 amino acids， and the relative molecular mass was 57.4 kDa.This gene is highly expressed in the flowers of S.miltiorrhiza.One SNP was found in 42 samples （25 purple flowers; 17 white flowers） of S.miltiorrhiza plants.This locus showed a stable change related to flower color in S.miltiorrhiza with purple and white flowers.Phylogenetic analysis showed that F3′5′H had high sequence homology with the F3′5′H of Glandularia x hybrida.The hairy roots over-expressing F3′5′H were obtained.Conclusion：This study cloned and analyzed the F3′5′H from S.miltiorrhiza.These results lay the foundation for further research on the F3′5′ H function of Salvia miltiorrhiza .

Keywords?S.miltiorrhiza;Flavonoids-3′，5′-hydroxylase;Gene clone;Expression analysis;Bioinformatics analysis;SNP locus analysis;Flower color of S.miltiorrhiza;Transgenic hairy roots

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.006

花色是植物在花期的一個表現(xiàn)性狀，主要由存在于液泡中的色素物質決定[1-2]。這些色素主要包括類黃酮（Flavonoids）、類胡蘿卜素（Carotenoids）和甜菜色素（Betalains）。其中，類黃酮色素是植物中最常見的調控花色的色素，而花色素苷是類黃酮中一類主要的色素，它控制植物花的紅、藍、紫等顏色[3]?；ò曛蓄慄S酮化合物的羥基化模式決定了花瓣呈現(xiàn)的顏色，而類黃酮的羥基化過程由細胞色素P450（Cytochromes P450，CYP450）負責催化完成[4]。

在高等植物中，類黃酮-3′，5′-羥基化酶（Flavonoid-3′，5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H）和類黃酮-3′-羥基化酶（Flavonoid-3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H）是催化二氫黃酮到二氫黃酮醇的關鍵酶，它們催化花青素生物合成途徑中的羥基化過程。其中，F(xiàn)3′5′H催化花青素B環(huán)3′和5′位置的羥基化反應[5]。這兩類細胞色素P450都屬于CYP75亞家族[6]，是催化二氫黃酮到二氫黃酮醇的關鍵酶[7]?；ㄇ嗨谺環(huán)上的羥基數(shù)目影響著花的顏色，羥基數(shù)量越多藍色越深[4]。F3′5′H 在番茄（Solanum lycopersicum）[8]和瓜葉菊（Senecio cruentus）[9]等多種植物中已被克隆分離。在矮牽牛（Petunia hybrida）中異源表達蔓長春花（Vinca major）F3′5′H 基因使紅色矮牽牛的花瓣變?yōu)樽仙玔10]。在葡萄（Vitis vinifera L.cv Shiraz）中，VvF3′5′H 在紅葡萄的果皮中高豐度表達，而在白葡萄的果皮中表達量極低[11]。在一些觀賞植物如玫瑰和康乃馨中，如果F3′5′H 不表達，將導致不能形成藍色和紫色花。通過在玫瑰和康乃馨中表達F3′5′H ，產生了藍色玫瑰和藍色康乃馨[12]，這些藍色花卉被廣泛運用于商業(yè)化生產。

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）屬于雙子葉唇形科鼠尾草屬藥用植物，異花傳粉。自然界中丹參的花有白花、紫花或白色和紫色的混雜色（淺紫色）。在丹參基因組中，14個參與黃酮生物合成途徑的酶基因已被鑒定[13]，其中，丹參F3′5′H（SmF3′5′H）是一個單拷貝基因。為了進一步驗證SmF3′5′H的功能，我們在紫花丹參99-3品系中，分別克隆了SmF3′5′H的編碼區(qū)序列（cDNA）和基因組序列（gDNA）;并在栽培的白花丹參和紫花丹參（包含淺紫色花丹參）中，分別克隆了SmF3′5′H的cDNA序列。進一步對SmF3′5′H進行序列測定和比對分析，統(tǒng)計并篩選到一個與丹參花色（紫花和白花）相關的SNP位點。同時，利用毛狀根遺傳轉化方法[14]獲得了該基因的過表達轉基因毛狀根株系。本研究還分析了SmF3′5′H的表達譜，并預測了SmF3′5′H理化性質和蛋白特性，這些結果表明，SmF3′5′H是一個調控丹參花色的關鍵基因，為丹參花色研究奠定基礎。

1?儀器與試劑

1.1?儀器?冷凍高速離心機（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：Legend Micro 17R型），渦旋儀（賽洛捷克公司，美國，型號：1400059999型），96孔梯度PCR儀（賽默飛世爾科（中國）有限公司，型號：2990234871型），DYY-8C型電泳儀（伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司，型號：Power Pac型）。

1.2?試劑?RNAprep Pure植物多糖多酚總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，批號：R6313），PrimeScriptTM II 1st strand cDNA合成試劑盒（普洛麥格（北京）生物技術有限公司，批號：0000375832）;10×PCR Buffer與pyrobest DNA聚合酶（寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，貨號：R005A）。pEASY-Blunt Zero Cloning試劑盒（北京全式金生物公司，型號：CB501-02），質粒小提試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP103-03），普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP209-03），SYBR Premix Ex TaqTM（寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，貨號：RR820A）。

1.3?實驗材料?丹參99-3植株分別采自中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所試驗地和本實驗的組培苗。其他紫花和白花以及淺紫色花的丹參花序分別采自中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所試驗地和藥用植物園。采集樣品的花色見圖1所示。同時采集了2年生的紫花丹參的根、莖、葉、花。

2?方法與結果

2.1?RNA提取與質量檢測?將采得樣品每株分別清洗去除雜質后，用吸水紙吸干樣品表面水分，用鋁箔紙包裝并編號，立即置于液氮中速凍，并移至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取干凈的植物材料?0～100 mg），液氮研磨至均勻粉末，采用天根植物多糖多酚總RNA提取試劑盒提取總RNA。取1 μL RNase-Free ddH2O于Nanodrop 2000 Spectrophotometer儀器上設立空白對照，取1 μL RNA溶液進行濃度檢測，獲得RNA溶液濃度、OD260/OD280、OD260/OD230的數(shù)值。取2 μL RNA溶液和1 μL上樣緩沖液（Loading Buffer），補充3 μL RNase-Free ddH2O，混勻為6 μL樣品，制備1%濃度的瓊脂糖凝膠，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認RNA完整性及質量。

2.2?cDNA全長克隆?以提取的總RNA為模板，通過PrimeScriptTM II 1st strand cDNA試劑盒反轉錄得到cDNA。根據(jù)丹參基因組數(shù)據(jù)，選取F3′5′H基因的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）區(qū)域，設計基因全長擴增引物：SmF3′5′H-F/R，引物序列見表1。以cDNA為模板配制PCR反應體系，加入1 μL cDNA，0.1 μL Pyrobest DNA聚合酶，2.5 μL 10×Buffer和特異性基因全長擴增引物SmF3′5′H-F/R各0.1 μL，補充ddH2O至25 μL。設置PCR反應條件為：預變性95 ℃ 30 s;變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，30個循環(huán);72 ℃ 10 min;10 ℃保溫。將全部PCR產物通過凝膠電泳分離，將回收產物按照pEASY-Blunt Zero試劑盒提供的方法連接pEASY載體。取1 μL pEASY載體與4 μL回收產物混合，室溫反應5 min，將連接產物加入50 μL Trans-T1感受態(tài)細胞混合，冰浴30 min后，42 ℃水浴熱激90 s，再置于冰上孵育2 min，加入250 μL LB液體培養(yǎng)基，在150 r/min 37 ℃條件下恢復培養(yǎng)1 h。取200 μL轉化的感受態(tài)細胞的菌液涂布于含50 mg/L Amp（氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)。待生長出菌落后，挑單克隆進行菌落PCR驗證，取陽性菌株送中國農業(yè)科學院進行Sanger測序。

2.4?序列處理?獲得的測序結果為序列的正向測序結果和反向測序結果，原始數(shù)據(jù)均以AB1格式和SEQ格式儲存。原始數(shù)據(jù)中，包含低質量的接頭片段、低質量堿基和未測出的堿基。為排除這些干擾，需去掉這些不可讀的序列信息，獲得質量可靠的測序結果。使用Codoncode處理原始數(shù)據(jù)，包含以下步驟：1）將正反兩條序列的AB1文件打開，拼接獲得Contig序列。2）當正反兩條序列所得的測序結果不一致時，如含低質量堿基和未測出的堿基，則以測序質量高的一條測序結果為準。3）當同一條序列在某一位點出現(xiàn)套峰，則以峰高、峰銳的峰圖為準。

2.5?序列分析?使用DNAMAN將測序獲得的序列進行多序列比對，得到差異位點分布信息，篩選在紫花丹參和白花丹參樣品中穩(wěn)定變化的SNP位點。將克隆得到的正確丹參序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上BLAST搜索其他植物中的同源性序列，使用MEGA 6進行Clustal W多序列比對，并采用鄰接法（Neighbor-joining method）構建系統(tǒng)進化樹。使用ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）對全長氨基酸序列進行理化性質分析。使用Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/）進行保守結構域預測。同時，使用Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/interactive/）進行三維同源建模。

2.6?構建過表達載體?將2.2中測序正確的陽性菌株加入10 μL LB液體培養(yǎng)基中搖菌，按照質粒小提試劑盒的方法，取過夜培養(yǎng)的菌液提取質粒。設計SmF3′5′H基因全長的過表達（Over-expression，OE）引物，根據(jù)Gateway原理在引物前添加attB序列，所用引物名稱為：SmF3′5′H-OEF/R，引物序列見表1。以重組質粒pEASY-SmF3′5′H為模板，使用SmF3′5′H-OEF/R引物進行PCR擴增。將PCR產物回收，再將回收產物進行BP反應，BP反應體系：25 ng attB-PCR回收產物，75 ng pDONR221入門載體，1 μL LR clonase II enzyme，補充ddH2O至5 μL。將其反應連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，用含50 mg/L Kan（卡那霉素）的LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，回收pDONR221-SmF3′5′H重組質粒進行LR反應;LR反應體系：75 ng pDONR221-SmF3′5′H回收產物，75 ng pK7WG2D受體載體，1 μL LR clonase II enzyme，補充ddH2O至5 μL。反應連接產物轉入DH5α感受態(tài)細胞，取200 μL菌液涂布于含50 mg/L Spec（壯觀霉素）的LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，菌落PCR檢測后選擇陽性菌株送公司測序;取測序正確的克隆提取重組質粒pK7WG2D-SmF3′5′H，將重組質粒（pK7WG2D-SmF3′5′H）和空載體（pK7WG2D）分別轉入發(fā)根農桿菌ACCC10060中，分別獲得SmF3′5′H的過表達毛狀根株系（ZC-OE）和對照株系（ZC-pk-OE）。

2.7?侵染丹參葉片?取生長旺盛的丹參組培苗幼嫩葉片，剪切成0.5 cm2大小的葉盤于MS培養(yǎng)基25 ℃預培養(yǎng)2 d。將轉化得到發(fā)根農桿菌ACCC10060 28 ℃培養(yǎng)于含50 mg/L Spec+50 mg/L Rif（利福平）的液體YEB培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.4～0.6，使用MS培養(yǎng)基重懸菌體，混合侵染后置于MS平板上，25 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)48～72 h。將共培養(yǎng)的葉盤分別用無菌水和含500 mg/L Car（羧芐青霉素）的無菌水中洗干凈后，置于含500 mg/L Car+50 mg/L Kan的MS平板上，25 ℃黑暗條件下篩選培養(yǎng)，選擇長勢良好的毛狀根，待其生長至2.0～3.0 cm后切下，置于含200 mg/L Car+15 mg/L Kan+0.1 mg/L IAA的6，7-V固體培養(yǎng)基上刺激一周后轉接至不含IAA的固體培養(yǎng)基，待長出較多側根后，使用熒光顯微鏡檢測載體質粒含有的標簽蛋白——綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，判斷轉基因毛狀根是否為陽性株系。將選擇3株陽性株系標記為ZC-OE-1、ZC-OE-2和ZC-OE-3轉接至6，7-V液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.8?丹參F3′5′H表達分析?取液體培養(yǎng)1個月的只轉化了空載體的對照株系（PK）和過表達株系（OE）毛狀根，以及采集的丹參根、莖、葉、花器官，分別提取總RNA，再將這些RNA反轉錄為cDNA。挑選SmF3′5′H基因特異性片段設計實時定量PCR（qRT-PCR）引物：SmF3′5′H-qF/R，引物序列見表1。以丹參SmACTIN（HM231319.1）作為內參基因，制備qRT-PCR體系：2×SYBR Premix Ex Taq II 2.5 μL，cDNA模板1 μL，引物各1 μL，RNase-free ddH2O 4.5 μL。qPCR反應條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。65～95 ℃時做熔解曲線，收集Ct值，以2-△△Ct方法[15]計算不同樣品間該基因相對表達量。

2.9?結果

2.9.1?SmF3′5′H全長克隆及序列比對?以紫花丹參99-3株系的cDNA和基因組DNA為模板，分別克隆得到了SmF3′5′H的cDNA的完整ORF和基因組序列。該基因cDNA全長為1 551 bp，編碼516個氨基酸;該基因的基因組序列全長1 634 bp，經與cDNA序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該基因的基因組序列（gDNA）中含有一段長為83 bp的內含子序列。見圖2。在采集的42株丹參樣品中，17株為白花丹參，標記為B（白花）;25株為紫花丹參，標記為Z（紫花），其中3株為淺紫花丹參，標記為QZ（淺紫花）。

在紫花丹參和白花丹參F3′5′H基因序列的1 230 bp處存在一個與丹參花色相關的SNP位點，見圖3所示。我們發(fā)現(xiàn)，在紫花丹參中，該處的堿基為C;在白花丹參中，該處堿基為T;在淺紫色花丹參中，該處的堿基為C或T。經仔細核對序列的測序峰圖，發(fā)現(xiàn)在淺紫色花丹參中，該位點處都為C/T雙峰。見圖4。依據(jù)堿基相應的峰高情況選擇此處位點對應的堿基，所以，我們發(fā)現(xiàn)在三株淺紫花丹參中，有兩株丹參在此位點的堿基為C，另一株淺紫花丹參此位點的堿基為T。見圖3。因為丹參為常異花授粉植物，推測淺紫色花丹參可能與白花丹參和紫花丹參的天然雜交有關，因此，該位點在淺紫色花丹參中為C或T。除此位點外的其他SNP位點均不與丹參花色——白花、紫花和淺紫花這一性狀具有明顯的相關性，見圖3中所示的1 189 bp處的A/G這一SNP位點。

2.9.2?SmF3′5′H序列分析和三維同源建模?利用ExPASy對SmF3′5′H蛋白質序列的理化性質進行預測分析，結果顯示SmF3′5′H的蛋白質相對分子質量為57.4 kDa，等電點為8.77。根據(jù)Interpro預測結果，SmF3′5′H屬于CYP450超基因家族，Interpro數(shù)據(jù)庫中SmF3′5′H同源序列的序號為IPR002401。預測分析發(fā)現(xiàn)，在SmF3′5′H氨基酸序列的7～29位點處有跨膜螺旋結構，1～7位點處為該蛋白質的細胞質結構域，29～516位點為非細胞質結構域，見圖5所示。SmF3′5′H蛋白質序列的三維同源建模以Swiss-Model數(shù)據(jù)庫中的5ylw.1.A蛋白質為模板，SmF3′5′H蛋白質序列與模板蛋白質序列相似度為33.62%。見圖6。

2.9.3?F3′5′H系統(tǒng)進化分析?將SmF3′5′H氨基酸序列與其他植物F3′5′H氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析。這些植物包括棉花（Gossypium hirsutum）、葡萄（Vitis vinifera）、大豆（Glycine max）、番茄（Solanum tuberosum）、矮牽牛（Petunia x hybrida）、蔓長春花（Vinca major）、長春花（Catharanthus roseus）、洋桔梗（Eustoma grandiflorom）、夏堇（Torenia hybrid cultivar）、美女櫻（Glandularia x hybrida）。選擇以上植物的F3′5′H氨基酸序列均來自于Genbank數(shù)據(jù)庫。繪制F3′5′H的進化樹見圖7所示，SmF3′5′H與美女櫻和夏堇中的F3′5′H親緣關系較近。

2.9.4?SmF3′5′H過表達的轉基因毛狀根獲得?將含有SmF3′5′H基因的質粒轉入發(fā)根農桿菌（ACCC10060）最終獲得轉基因毛狀根，見圖8a。使用熒光顯微鏡檢測毛狀根中的GFP蛋白的綠色熒光情況，發(fā)現(xiàn)所獲得的轉基因毛狀根有綠色熒光，見圖8b，表明轉基因毛狀根構建成功。利用qRT-PCR方法檢測了不同轉基因毛狀根株系中SmF3′5′H的相對表達量，與對照株系相比，發(fā)現(xiàn)該基因的表達水平在ZC-OE-2過表達株系顯著增高，而在ZC-OE-3株系中略有增高，在ZC-OE-1中該基因的表達水平與對照株系相近。見圖9。這個實驗結果表明，我們初步獲得了SmF3′5′H過表達轉基因毛狀根株系ZC-OE-2，可用于后續(xù)基因功能研究。

2.9.5?SmF3′5′H的表達譜分析?利用SmF3′5′H的qRT-PCR的引物，以2年生丹參的根、莖、葉、花的cDNA為模板，檢測了該基因在丹參不同器官中的表達特點。結果表明，該基因在丹參花（zc-F）中顯著高豐度表達，在莖（zc-S）中的表達量次之，在根（zc-R）和葉（zc-L）中表達量較低。見圖10。

3?討論

由于F3′5′H參與植物花青素的生物合成過程，所以對植物花色形成具有關鍵作用。研究F3′5′H基因及其編碼蛋白質的理化特性和功能，有助于闡明植物花色的形成機制。本研究從丹參中克隆到SmF3′5′H基因的cDNA和gDNA序列，并發(fā)現(xiàn)該基因序列中只含有一個內含子，其編碼區(qū)包含2個外顯子。見圖2。在丹參基因組[16]中，該基因是一個單拷貝基因，這與矮牽牛中有2個基因（Hf1和Hf2）編碼F3′5′H不同[17]，并且矮牽牛這2個基因功能不同[18-19]。由此推測SmF3′5′H在決定丹參花色性狀方面發(fā)揮關鍵作用。在分析采自試驗地里的42株丹參樣品的SmF3′5′H cDNA序列時發(fā)現(xiàn)在1 230 bp處，有一個SNP位點與丹參的白花和紫花性狀具有相關性，見圖3;并且在3株淺紫色花丹參中，發(fā)現(xiàn)此位點處堿基的峰圖是C/T雙峰，見圖4，推測這可能是由于這些丹參在試驗地里生長時發(fā)生過自然雜交，子代分離從而導致花色分離的現(xiàn)象。將從白花丹參中克隆獲得的SmF3′5′H與GenBank中的SmF3′5′H（MH447665.1）經過比對發(fā)現(xiàn)，這兩條序列僅存在2個堿基差異，分別存在于1 189 bp和1 230 bp處。其中，GenBank中SmF3′5′H與克隆到的白花丹參SmF3′5′H的1 189 bp處堿基位點分別為G和A，這樣的堿基差異引起相應的SmF3′5′H 397氨基酸位點從天冬氨酸（D）到天冬酰胺（N）的改變;而這2個SmF3′5′H（MH447665.1和本研究克隆的SmF3′5′H）在1 230 bp處堿基分別為C和T（序列比對結果未顯示），由此表明SmF3′5′H在丹參不同個體的基因組中其序列相對較為保守;且GenBank中的丹參F3′5′H序列可能從紫花丹參中分離獲得。大多數(shù)類黃酮生物合成酶被認為是可溶性蛋白，固定于內質網膜上發(fā)揮代謝引導作用，使黃酮類化合物的合成代謝途徑更高效[20-21]。SmF3′5′H屬于CYP450，而CYP450主要分布在內質網和線粒體內膜上，作為一種末端加氧酶，參與了生物體內的多種代謝物的生物合成過程。生物信息學預測結果表明，SmF3′5′H蛋白N端具有跨膜結構域，見圖5，表明它可能是個膜蛋白。qRT-PCR檢測到SmF3′5′H在丹參花中顯著性高表達，見圖10，暗示該基因主要參與花中類黃酮化合物的生物合成途徑。本研究還獲得了過表達SmF3′5′H的轉基因毛狀根，這為進一步研究該基因的功能奠定基礎。隨著本草基因組學研究[22-23]的不斷深入，多組學技術的不斷發(fā)展和完善，極大地促進了丹參作為藥用模式植物[24]的功能基因組學研究，因此，開展SmF3′5′H調節(jié)丹參花色形成機制的研究，具有重要理論意義;同時，我們發(fā)現(xiàn)了一個與丹參花色性狀緊密相關的SNP位點，該位點為后續(xù)開展基于花色的丹參品種鑒定及優(yōu)良種質選育提供靶基因。

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（2020-02-10收稿?責任編輯：徐穎）