余雙寶

(福建省羅源縣林業(yè)局,福建 羅源 350600)

1 引言

我國(guó)針葉樹種產(chǎn)脂造林鄉(xiāng)土樹種中分布面積最廣就是馬尾松。但是近幾年發(fā)現(xiàn)馬尾松在生長(zhǎng)的時(shí)候會(huì)普遍發(fā)生松材線蟲病，該病的特點(diǎn)是發(fā)病快、容易傳播，是一種非常有毀滅性的松樹病害，必須從根本上抵御松材線蟲病。組織培養(yǎng)有很多的優(yōu)點(diǎn)：如組織培養(yǎng)的速度非?？臁⒃偕史浅８叩?，并且組織培養(yǎng)能夠真正的實(shí)現(xiàn)對(duì)馬尾松的大規(guī)模的繁殖。通過(guò)對(duì)抗性馬尾松合子胚作為實(shí)驗(yàn)的材料獲得再生的植株，有可能保證本身的優(yōu)良抗性，還有可能比親本抗性更強(qiáng)或更弱，需要一定的田間子代測(cè)試，利用測(cè)試選擇優(yōu)良的，淘汰一些抗性差的。隨后對(duì)這些胚性細(xì)胞進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)和田間種植?，F(xiàn)在有很多研究者也開(kāi)始借鑒之前研究紅松的經(jīng)驗(yàn)來(lái)研究馬尾松。如黃健秋在研究中采用3個(gè)品種的馬尾松作為實(shí)驗(yàn)的材料，建立一系列的馬尾松體胚發(fā)生的體系。但是建立的體系還存在一些問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)中的再生植株率只達(dá)到7.4%，且也解決不了誘導(dǎo)率低和再生植株的問(wèn)題。所以本研究通過(guò)分析一些抗松材線蟲病馬尾松還沒(méi)有成熟的種子，對(duì)抗性馬尾松胚性愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)和優(yōu)化，建立抗性馬尾松懸浮培養(yǎng)T恤和抗性馬尾松體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生體系，在研究的時(shí)候獲得了一些再生的植株，給培育抗病馬尾松做出了參考[1～3]。

2 材料和方法

2.1 外植體材料的主要來(lái)源和處理方法

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候選擇的是福州市羅源縣采集出來(lái)的一些正在發(fā)育的抗性馬尾松未成熟的球果，從中最終選定4株，每株選擇6個(gè)球果，采集完成之后放在大概是4 ℃的冰箱里面保存7 d左右。在進(jìn)行試驗(yàn)之前要先對(duì)種子的表面進(jìn)行一定的消毒處理，之后在把它們放在75%的乙醇中，放置的時(shí)間在30 s左右，之后在放進(jìn)0.1%的HgCl2里面進(jìn)行滅菌處理，消毒之后還需要對(duì)種子進(jìn)行一定的沖洗，最后選出來(lái)的就是抗性馬尾松未成熟合子胚[4]。

2.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理抗性馬尾松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率測(cè)定

在做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候使用的是抗性馬尾松和15-1家系未成熟的種子，以LP、DCR為基本的培養(yǎng)基，在進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，在培養(yǎng)基里面需要放上以下幾種材料：30g/L的麥芽糖、谷氨酰胺450 mg/L,NES250 mg/L等，一共需要配置12皿，在每皿中放入3粒種子，重復(fù)進(jìn)行3次左右，培養(yǎng)1～2個(gè)月之后觀察愈傷組織的誘導(dǎo)率[5，6]。計(jì)算誘導(dǎo)率的時(shí)候可以用以下的公式算出：

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的外植體的個(gè)數(shù)/接種總外值體數(shù)×100%

(1)

2.3 懸浮和固體培養(yǎng)下胚性愈傷組織的維持與增值測(cè)定

在測(cè)定的時(shí)候主要使用的是誘導(dǎo)的抗性馬尾松馬7-6家系愈傷組織為材料，之后在增殖的時(shí)候使用液體懸浮培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種方法，固體培養(yǎng)的繼代周期為15 d左右，液體懸浮培養(yǎng)的繼代周期為7 d左右。在固體培養(yǎng)的時(shí)候要用LP為基本的培養(yǎng)基，之后在添加二氯苯氧乙酸和瓊脂粉等，之后在稱量剛開(kāi)始的接種質(zhì)量和15 d之后的愈傷組織質(zhì)量。在液體培養(yǎng)的時(shí)候首先需要取1 g的愈傷組織作為剛開(kāi)始的接種量，之后在放入液體培養(yǎng)中進(jìn)行打散處理，培養(yǎng)7 d之后，在測(cè)定沉降細(xì)胞的體積。測(cè)定的方法就是把錐形瓶里面的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞倒進(jìn)有刻度的試管中，放置30 min之后，等細(xì)胞完全沉淀之后在讀取體積的數(shù)值[5,6]。

2.4 IBA和NAA組合處理抗性馬尾松體胚胚苗根系生長(zhǎng)發(fā)育狀況測(cè)定

在測(cè)定的時(shí)候使用的是誘導(dǎo)的抗性馬尾松馬7-6家系的細(xì)胞系誘導(dǎo)分化出來(lái)的體胚，之后在添加一些IBA和NAA，在放在設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基里面觀察50 d之后，看其體胚苗生長(zhǎng)的狀態(tài)和生根的情況。

2.5 油菜素內(nèi)酯處理抗性馬尾松體胚苗生長(zhǎng)狀況測(cè)定

在測(cè)定的時(shí)候用抗性馬尾松馬7-6家系誘導(dǎo)分化出的大概1～2 cm的體胚苗作為測(cè)定的材料，在材料里面添加油菜素，之后在放到培養(yǎng)基里面進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的時(shí)候溫度需要保持在24 ℃，在40 d之后在觀察體胚的生長(zhǎng)情況。

2.6 抗性馬尾松體胚苗的馴化和移栽

在馴化的時(shí)候需要選擇一些比較強(qiáng)壯的體胚苗進(jìn)行，之后在煉苗，在煉苗的時(shí)候同時(shí)還需要保證溫度，適當(dāng)?shù)臅r(shí)候還需要撒一些水。在把馴化后的支柱進(jìn)行移栽，在移栽之后需要保證育苗的溫度和濕度，之后認(rèn)真照顧，在種植3個(gè)月之后統(tǒng)計(jì)植株的成活率。在測(cè)量植株的成活率的時(shí)候可以用以下的公式：

植株的成活率=植株成活的株數(shù)/一共移栽的株數(shù)×100%

(2)

3 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和實(shí)驗(yàn)的分析

3.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表1 不同基本培養(yǎng)基和激素濃度對(duì)抗性馬尾松愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：外植體個(gè)數(shù)為36

通過(guò)表1分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性馬尾松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳配比就是LP+2.0 mg/L,4-D+1.0 mg/L6-BA,這個(gè)時(shí)候的誘導(dǎo)率能夠達(dá)到27.8%。這種程度下就能保持穩(wěn)定的增值狀態(tài)。在進(jìn)行誘導(dǎo)的時(shí)候還發(fā)現(xiàn)如果在過(guò)程的時(shí)候加入一些AgNO3還能夠提高一些組織的誘導(dǎo)率。

3.2 懸浮和固體培養(yǎng)對(duì)胚性愈傷組織維持與增值的影響

通過(guò)圖1分析結(jié)果能夠發(fā)現(xiàn)，對(duì)于2種不同的培養(yǎng)條件下抗性馬尾松胚性愈傷組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察的時(shí)候能夠知道固體培養(yǎng)的周期比較長(zhǎng)，在愈傷組織的時(shí)候會(huì)比較的省時(shí)間和省精力；懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞活性會(huì)更高，在大量繁殖的時(shí)候懸浮培養(yǎng)會(huì)更合適。

A.固體培養(yǎng)增殖的細(xì)胞 B.懸浮培養(yǎng)增殖的細(xì)胞 圖1 不同培養(yǎng)方式下抗性馬尾松的細(xì)胞結(jié)構(gòu)

3.3 IBA與NAA濃度組合對(duì)抗性馬尾松體胚根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析能夠知道1.0 mg/LIBA+0.2 mg/LNAA是最佳的組合狀態(tài)。

3.4 油菜素內(nèi)脂對(duì)抗性馬尾松體胚苗壯苗的影響

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析能夠知道在沒(méi)添加油菜素的時(shí)候雖然也會(huì)生長(zhǎng)但是生長(zhǎng)的比較緩慢，加入油菜素會(huì)有助于胚苗的生長(zhǎng)。

3.5 抗性馬尾松再生植株的移栽

在移栽的時(shí)候發(fā)現(xiàn)當(dāng)移栽的樹苗在5 cm的時(shí)候成活率能夠達(dá)到90%，8cm的時(shí)候成活率能夠達(dá)到82.9%，所以在移栽的時(shí)候苗高在5～7 cm是最合適的移栽時(shí)機(jī)。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析可知抗性馬尾松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的優(yōu)化的過(guò)程，在對(duì)體細(xì)胞胚增值進(jìn)行增值、分化和萌發(fā)、移栽等，能夠培育出需要的再生植株。雖然在培養(yǎng)的時(shí)候還是會(huì)出現(xiàn)很多的問(wèn)題，但現(xiàn)在已經(jīng)能夠達(dá)到大量繁殖的要求。