徐忠*，王友健，陳曉明，趙丹，高陽，馮昕寧

哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院（哈爾濱 150076）

豌豆學(xué)名Pisum sativum Linn.，又名青豆、畢豆、荷蘭豆、國豆等，作為第二大食用豆類作物，世界上約65個國家生產(chǎn)豌豆，中國豌豆年產(chǎn)量為160萬 t左右，約占世界豌豆總產(chǎn)的9%。從營養(yǎng)學(xué)看，豌豆營養(yǎng)豐富，其淀粉含量55%～68%，而蛋白含量20%～30%，粗纖維含量8%～10%，脂肪含量低于2%。由于豌豆含有豐富的淀粉，除食用外，主要用于生產(chǎn)豌豆淀粉及相關(guān)產(chǎn)品。豌豆蛋白是豌豆的重要組成部分，其生物價48%～64%，功效比0.6～1.2，且不易過敏，具有較高的營養(yǎng)價值。豌豆蛋白的氨基酸比例較為均衡，除蛋氨酸以外的其他7種人體必需氨基酸的含量均接近FAO/WHO推薦模式值，易于消化吸收，同時賴氨酸含量較高，是一種良好的蛋白質(zhì)來源。因此，綜述近年來豌豆蛋白及其抗氧化肽的提取方法、分析豌豆蛋白的理化性質(zhì)及其抗氧化肽的生物活性，為豌豆蛋白的生產(chǎn)和綜合開發(fā)利用提供參考[1]。

1 豌豆蛋白的制取

1.1 堿溶酸沉法

豌豆蛋白的常用制取方法為堿溶酸沉法，一般是先用堿性溶液促使蛋白質(zhì)溶解，使固液分離后得到粗蛋白液，加酸調(diào)節(jié)pH到等電點，分離得到蛋白沉淀，經(jīng)洗滌、中和、干燥即得分離蛋白產(chǎn)品。此法生產(chǎn)的分離蛋白可有效除去可溶性糖類和不溶性聚糖，因而蛋白質(zhì)含量較高。該法具有操作簡單、易于控制、成本低廉等優(yōu)點。主要操作步驟為：豆粕→堿提→離心分離→上清液→酸沉→離心分離→沉淀→洗滌→中和→冷凍干燥→豌豆分離蛋白。

井雪蓮等[2]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了提取工藝參數(shù)：料液比1∶23，浸泡時間53 min，浸泡溫度47 ℃，pH 8.8。在最佳提取條件下蛋白質(zhì)的提取率為86.73%，蛋白質(zhì)含量為87.61%。

沙金華[3]利用正交試驗優(yōu)化提取工藝參數(shù)：固液比1∶30，pH 9.0，提取溫度45 ℃，提取時間50 min。在最佳提取條件下蛋白質(zhì)的提取率為81.82%，蛋白質(zhì)含量為91.23%。

1.2 鹽提透析法

鹽提透析法是利用蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中的溶解度不同，從而沉淀分離出粗蛋白，再經(jīng)過膜透析除去鹽，得到蛋白質(zhì)產(chǎn)品。此法具有操作簡單、重復(fù)性好、成本低廉、提取率高等優(yōu)點[4]。

Stone等[5]將脫脂豌豆粉與含6.4% KCl的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 8.0）按1∶10（g/mL）的比例混合。室溫下攪拌24 h，利用離心力4 500×g的離心機在4 ℃離心下20 min。收集上清液，經(jīng)過透析后，將透析液凍干。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)提取率為74.8%，蛋白質(zhì)含量為71.5%。單宏[6]利用0.3 mol/L的NaCl溶液提取，利用透析制得豌豆分離蛋白，此法將蛋白質(zhì)含量提升到81.91%。

1.3 膜分離法

膜分離法主要是根據(jù)植物蛋白的形狀及分子量大小，利用超濾膜對分離組分的選擇性，截留分子量較大的各種蛋白質(zhì)分子，使非截留組分排除，將蛋白質(zhì)濃縮和分離，并保留在截留物中，可以得到較高含量的蛋白質(zhì)。

Boye等[7]采用超濾技術(shù)提取豌豆蛋白是在pH 6.0條件下，用截留相對分子質(zhì)量50 000 u的超濾膜對豌豆蛋白粗提液進行超濾分離。利用這種分離方法其蛋白含量為83.9%，蛋白質(zhì)提取率為57.1%。李寶艷等[8]選擇截留相對分子質(zhì)量8 000 u的超濾膜對豌豆蛋白粗提液進行超濾分離，并且優(yōu)化膜分離的最佳溫度、壓力、pH分別為45 ℃、0.8 MPa、pH 8.0，其成品中粗蛋白含量可達91%。

1.4 超聲波法輔助提取

超聲波輔助法提取蛋白是近年來新興的提取方法，此法具有時間短，提取效率高、操作方便，安全無污染等優(yōu)點[9]。

沙金華[3]在堿溶酸沉的基礎(chǔ)上，加入超聲波輔助提取豌豆蛋白，得到的最佳工藝條件為：固液比1∶20，超聲功率300 W，提取時間30 min。根據(jù)最佳提取條件得到的蛋白質(zhì)的提取率為83.21%，蛋白質(zhì)含量為90.10%。

2 豌豆蛋白理化性質(zhì)[10-12]

2.1 豌豆蛋白營養(yǎng)成分

張秋萍[13]對豌豆蛋白進行營養(yǎng)成分的分析，其中蛋白質(zhì)含量76.5%，淀粉含量4%，纖維素含量5.5%，脂類含量1%，灰分5%，水分6%。

2.2 溶解性

豌豆蛋白溶解度為25%，與黃豆蛋白相比，豌豆的水溶性蛋白含量更多，溶解性好的蛋白質(zhì)一般也具有較好的乳化性和凝膠性等功能性質(zhì)，蛋白質(zhì)溶解性越好，蛋白的應(yīng)用范圍則越廣泛。通過噴射蒸煮等方法可提高豌豆蛋白的溶解性，制備高溶解性豌豆蛋白[14]。

2.3 乳化性、起泡性和凝膠性

豌豆蛋白的乳化活性為11.26 m2/g，乳化穩(wěn)定性為14.28 min[15]，高于黃豆蛋白，豌豆蛋白的起泡性和穩(wěn)定性低于黃豆蛋白，這可能是因為豌豆蛋白中的7S球狀蛋白含量比黃豆中的多，而11S球狀蛋白的含量比黃豆蛋白中的少多造成的，研究證明7S比11S有更好的降低表面張力的能力，11S比7S有更好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，主要是它們的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的不同：7S的疏水氨基酸含量高，在它的表面存在大量疏水區(qū)；而11S因其內(nèi)部含有亞基間和亞基內(nèi)的二硫健，另外11S還帶高電荷，這些都是造成2種分離蛋白功能特性不同的原因。

將蛋白分散于水中形成溶膠體，溶膠體在一定外界條件下即可形成凝膠，豌豆蛋白形成凝膠的最低溫度為80 ℃，最低蛋白濃度為15%，在離子強度為0.2 mol/L時凝膠強度最好，通過鹽提取法可以制備高凝膠性豌豆蛋白[6]。

2.4 生產(chǎn)應(yīng)用

由于豌豆蛋白具有良好的乳化性和凝膠性等功能特性，可以作為食品添加劑用于谷物食品、乳制品和肉制品等加工中，起到改善產(chǎn)品品質(zhì)和營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的作用。孫聃等[16]研究把豌豆蛋白及豌豆粉添加到饅頭中，能有效改善面粉的粉質(zhì)特性，提高饅頭的營養(yǎng)價值。豌豆蛋白質(zhì)添加量4%，豌豆粉添加量10%以內(nèi)時，饅頭的感官評分比未添加蛋白質(zhì)及豆粉要高，同時豌豆蛋白及豌豆粉的添加有助于延緩饅頭老化，延長饅頭貨架期。Mercier等[17]把豌豆蛋白粉添加到意大利面條中，改善面粉粉質(zhì)特性，提高面條營養(yǎng)價值。王英[18]將豌豆蛋白添加到Mozzarella干酪中，減少凝乳時間，增加凝乳強度、成品的彈性、黏聚性、咀嚼性和拉伸長度，并且這些指標均高于添加大豆蛋白和綠豆蛋白的Mozzarella干酪。計紅芳等[19]將豌豆蛋白添加到雞肉糜中，提高雞肉糜凝膠形成的能力，使雞肉糜凝膠的品質(zhì)得到明顯改善，同時提高雞肉糜凝膠的蒸煮得率和保水性，改善雞肉糜的食用特性。

3 豌豆肽的提取

3.1 化學(xué)法

化學(xué)法即采用酸、堿化學(xué)試劑在一定溫度下促使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂形成小分子多肽，雖然化學(xué)法有方法簡單、成本低廉等優(yōu)點，但反應(yīng)條件劇烈，營養(yǎng)成分易損失，反應(yīng)過程中氨基酸受損較嚴重，破壞氨基酸的構(gòu)形，副反應(yīng)多并可形成如賴氨酸-丙氨酸等有毒副作用的物質(zhì)，且很難按規(guī)定的水解程度控制水解，易造成環(huán)境污染，因此現(xiàn)在這種工藝已較少采用[20]。

3.2 酶水解法

酶法水解蛋白制備蛋白多肽是目前生產(chǎn)蛋白肽的主要方法，其反應(yīng)條件溫和，不會造成環(huán)境污染，反應(yīng)效率高，不產(chǎn)生消旋作用，產(chǎn)物易分離，水解程度易控制，且能較好地保存氨基酸的營養(yǎng)價值和多肽的生物活性。刁靜靜等[21]采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶和中性蛋白酶制備豌豆肽，并采用單因素試驗方法進行不同底物質(zhì)量分數(shù)、水解時間、不同酶與底物質(zhì)量比對豌豆肽的水解度及肽得率的影響，最終篩選出制備高得率豌豆肽的工藝參數(shù)為：堿性蛋白酶、底物質(zhì)量分數(shù)7%，酶與底物質(zhì)量比3%，水解3 h。其水解產(chǎn)物水解度為29%，肽得率為67.15%。

3.3 復(fù)合酶水解法

內(nèi)肽酶可以降低產(chǎn)品中游離氨基酸的相對含量，外肽酶能選擇作用于疏水性氨基酸，去掉或減輕產(chǎn)物中的苦味；為提高底物轉(zhuǎn)化率，較好的方法是內(nèi)肽酶和外肽酶混合使用。一種方法是復(fù)合酶同時使用，另一種方法是不同的酶依次分步進行水解。秦修遠等[22]利用堿性和中性蛋白酶對豌豆蛋白進行雙酶水解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豌豆肽有92.95%分布在分子量1 000 Da之下，且氨基酸含量豐富，谷氨酸、亮氨酸和賴氨酸比例高。豌豆肽抗氧化功能較強，對于DPPH自由基、OH自由基的清除能力IC50值分別為3.39±0.02 mg/mL和23.72±0.10 mg/mL，同時也具有較高的還原能力。

4 豌豆肽的生物活性

4.1 抗氧化性

刁靜靜等[23]將豌豆蛋白用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶水解0.5～6 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物與其他酶的水解產(chǎn)物相比，具有較高的抗氧化活性。經(jīng)凝膠分離后發(fā)現(xiàn)抗氧化活性較高的豌豆肽的平均分子量約640 Da左右，其DPPH·的清除率為45.12%。而郭興鳳等[24]直接使用堿性蛋白酶對豌豆蛋白進行水解，同時還利用響應(yīng)面的方法對堿性蛋白酶水解條件進行優(yōu)化，得到最佳酶解工藝條件為：酶解溫度56.5 ℃，酶解時間3.2 h，pH 6.1，加酶量3.0%，底物濃度3.0%。在此條件下，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物對DPPH·的清除率為47.83%。

李慧等[25]在利用中性酶水解前，對豌豆蛋白進行擠壓處理。在擠壓過程中，在溫度、壓力和剪切力的作用下，使維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力減弱，使其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展，由球狀轉(zhuǎn)為纖維狀，并使分子間氫鍵、二硫鍵等化學(xué)鍵斷裂。此外，擠壓后的物料游離氨基的含量增加，使得擠出物的消化率升高，蛋白質(zhì)的酶解速度加快。采用透析和高效液相相結(jié)合的方法，對酶解產(chǎn)物進行分離及分子量的確定。分離得到小于1 ku、1～3.5 ku、3.5～7 ku和大于7 ku的酶解液。經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)分子量小于1 ku的酶解液O2-·清除率最高，達到78.31%，其分子量集中在200～800 u左右，為2～8肽。將豌豆蛋白擠出物經(jīng)中性蛋白酶酶解后，以DPPH和·OH清除率為評價指標，得出最佳DPPH清除率、·OH清除率分別為98.20%和82.30%，此結(jié)果的酶解條件為：加酶量12.20%、溫度40.20 ℃、pH 6.99、底物濃度6.92%[26]。

Wang等[27]先利用電子束輻照（EBI）對豌豆蛋白進行預(yù)處理，再利用復(fù)合風味蛋白酶在最佳條件下水解豌豆蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輻照量50 kGy時，水解產(chǎn)物清除能力最強，DPPH自由基和ABTS+自由基清除活性水平分別比對照組提高32.73%和52.80%。

Pownall等[28]以豌豆黃籽蛋白為原料，經(jīng)嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）酶解得到豌豆黃籽蛋白源肽，用超濾法分離出＜3 kDa大小的豌豆黃籽蛋白肽（PPH）。利用陽離子交換柱將PPH分離為5個組分（F1～F5）。F1含陽離子電荷含量最低（7.5%），F(xiàn)5含陽離子電荷含量最高超過50%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含陽離子電荷最低的組分（F1）對DPPH自由基和過氧化氫（H2O2）的清除活性最強。同時發(fā)現(xiàn)隨著組分中的陽離子電荷含量的增加，清除O2-·和H2O2的能力減弱。

4.2 抗菌性

張秋萍[13]在試驗中發(fā)現(xiàn)豌豆分離蛋白木瓜蛋白酶的水解液對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有抗菌作用，即具有相對抗菌廣譜性。比較抑菌圈直徑大小可以看出，豌豆抗菌肽對革蘭氏陰性菌的能力明顯強于革蘭氏陽性菌，其中對金黃色葡萄球菌的抗菌效果最明顯，這可能與豌豆抗菌肽的抗菌機理有關(guān)，對不同菌種所產(chǎn)生的抗菌效果不同。

4.3 抗腫瘤特性

潘芬[29]研究豌豆蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物（APPH）和胰蛋白酶酶解產(chǎn)物（TPPH）在同樣的作用條件下對人肝癌細胞株HePG2、人乳腺癌細胞株MCF-7、人胃癌細胞株MGC 803、人肺癌細胞株A549和人正常肝細胞株L-02的抑制率，結(jié)果表明，豌豆蛋白和豌豆肽對人正常肝細胞株均沒有毒性，APPH對癌細胞株的抑制率高于TPPH，且APPH在0.01 mg/mL到10 mg/mL的作用質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對這幾株癌細胞的抑制作甩呈現(xiàn)出較好的時間劑量依賴關(guān)系，對這幾株癌細胞的最大抑制率在60%以上，APPH有作為抗腫瘤活性物質(zhì)來源的潛力。

4.4 促進益生菌生長

潘芬等[30]研究堿性蛋白酶水解豌豆蛋白后的酶解產(chǎn)物對于17種常見益生菌生長的影響。研究發(fā)現(xiàn)添加4 mg/mL的酶解產(chǎn)物，可顯著改善干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌等益生菌在MRS培養(yǎng)基中的生長，其菌體密度提高10.78%～49.34%，活菌數(shù)提高1～3個數(shù)量級，同時發(fā)現(xiàn)在脫脂乳培養(yǎng)基中，酶解產(chǎn)物對鼠李糖乳桿菌W119的促生長作用最強，能使其活菌數(shù)從4.23×108CFU/mL提高到7.47×1011CFU/mL。因此，豌豆蛋白酶解產(chǎn)物可顯著促進益生菌的生長，提高益生菌的存活率，縮短益生菌的生產(chǎn)時間。

4.5 降血壓

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）對調(diào)節(jié)血壓起著關(guān)鍵性的作用，血管緊張素I（AI）不具有活性，但是AI在ACE的作用下可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘难芫o張素II（AII），AII具有收縮血管平滑肌的活性功能，從而引起血壓升高。由于體內(nèi)ACE活性太高而引起的高血壓，可以通過抑制ACE活性，阻止血管緊張素II的生成和激肽降解的減少達到治療高血壓的目的。

朱玲[31]利用堿性蛋白酶酶解豌豆蛋白，發(fā)現(xiàn)其酶解產(chǎn)物具有較強的ACE抑制率，為36.02%±0.48%。并且利用超濾分離后發(fā)現(xiàn)，隨著分子量的增大，各組分的ACE抑制活性降低。因此將超濾得到的截留分子量小于1 000 Da的豌豆肽其分子量分布，其中分子量在300～500 Da的組分占60.39%，說明組分中2～4個氨基酸的肽段較多，ACE抑制肽多為分子量較小的短肽。

4.6 改善免疫抑制

張敏佳等[32]將小鼠隨機分為對照組，環(huán)磷酰胺（CTX）模型組及豌豆肽低、中、高劑量組5組，進行減弱免疫抑制動物實驗。結(jié)果表明，豌豆肽能夠通過改善免疫器官發(fā)育、骨髓抑制狀態(tài)、免疫球蛋白含量、T淋巴細胞亞群百分比和細胞因子水平，改善CTX致免疫抑制小鼠的免疫功能，說明一定劑量的豌豆肽對CTX致免疫抑制小鼠的免疫功能具有一定的改善作用。

4.7 緩解胰島素抵抗

崔欣悅等[33]采用高濃度胰島素誘導(dǎo)人肝癌細胞HepG2建立IR細胞模型，利用不同濃度豌豆肽對胰島素誘導(dǎo)的HepG2細胞進行作用時，其葡萄糖消耗量提高1.31～1.68倍，InsR的表達水平提高1.19～1.34倍，凋亡蛋白Caspase-3陽性率表達增加，說明豌豆肽對肝細胞內(nèi)胰島素抵抗的形成具有一定緩解作用。

5 結(jié)語

中國的豌豆資源豐富、價格低廉，且豌豆蛋白質(zhì)含量高，是一種重要的植物蛋白資源。由豌豆蛋白制備得到的豌豆肽可以有效改善原料蛋白的各項理化特性，同時還能賦予產(chǎn)品特殊生物活性。通過酶降解其蛋白質(zhì)，改善其產(chǎn)品品質(zhì)是提高蛋白質(zhì)利用的重要方法，高溶解性，高凝膠性豌豆蛋白和低分子量抗氧化肽提取是今后研發(fā)的主要方向。開發(fā)豌豆蛋白和豌豆肽產(chǎn)品，不僅可以增加豌豆制品的附加值，同時也為豌豆淀粉廠豌豆粕的綜合利用提供途徑。