黃哲，李云澤，趙文嫣，楊明麗，馮勇

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1.結(jié)直腸疝微創(chuàng)外科；2.腫瘤內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004）

胰腺癌是一種惡性程度高、診治困難的惡性腫瘤，其中85%為起源于胰腺導(dǎo)管上皮的胰腺腺癌。胰腺癌的發(fā)病率和死亡率近年來(lái)明顯上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年胰腺癌已在全球范圍內(nèi)造成411 600人死亡［1-2］。胰腺癌侵襲性強(qiáng)，1年生存率和5年生存率分別為25%和5%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一［1，3］。胰腺癌初期多無(wú)明顯癥狀，待腫瘤增大導(dǎo)致膽管梗阻或轉(zhuǎn)移后，才可能因黃疸、疼痛等癥狀而被確診。多數(shù)患者手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大，圍術(shù)期死亡率較高，且僅有20%的患者就診時(shí)具備手術(shù)指征，多數(shù)患者確診時(shí)已喪失手術(shù)時(shí)機(jī)［4］。另一方面，患者對(duì)放化療等輔助治療反應(yīng)率低，術(shù)后短期內(nèi)常出現(xiàn)復(fù)發(fā)或進(jìn)展。因此，尋求合理有效、以延長(zhǎng)生存期及提高生存質(zhì)量為主的綜合治療是目前研究的重點(diǎn)。

吉西他濱是一種脫氧胞苷類似物，屬嘧啶類，是細(xì)胞周期特異性抗腫瘤代謝類藥物，主要作用于S期細(xì)胞，抑制DNA合成，并可阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局許可及美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南認(rèn)證，目前已廣泛作為胰腺癌患者一線化療用藥［5-6］。目前吉西他濱治療方案用于胰腺癌已成為臨床共識(shí)，但單藥治療收益有限，合并5-氟尿嘧啶等其他化療藥物及厄洛替尼等靶向藥物亦反應(yīng)率低，且不良反應(yīng)大，尚無(wú)有效證據(jù)明顯延長(zhǎng)生存時(shí)間及總生存率，生存質(zhì)量亦無(wú)明顯提升。因此，尋求合理的輔助治療方法及藥物迫在眉睫。香菇多糖是從菌類香菇中分離得到的具有β-1，6支鏈和β-1，3支鏈的葡聚糖［7］，是一種常用的免疫調(diào)節(jié)劑，具有免疫激活和抗腫瘤活性［8］，在臨床上已廣泛用于胃癌、食管癌、肺癌、血液系統(tǒng)腫瘤的輔助治療。它能夠減少化療不良反應(yīng)，提高免疫系統(tǒng)活性，改善生活質(zhì)量。這可能與用藥后免疫應(yīng)答增強(qiáng)，及其自身化學(xué)結(jié)構(gòu)影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、能量代謝等生物學(xué)活動(dòng)有關(guān)［9］。

目前，針對(duì)香菇多糖和吉西他濱聯(lián)合用藥抑制胰腺癌的研究尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究使用人轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC-1為研究對(duì)象，探討不同給藥方式對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為臨床更好地治療胰腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：ASPC-1人轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司）；胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司）；吉西他濱（法國(guó)Lilly公司）；香菇多糖（大連金港藥業(yè)有限公司）；MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；兔抗survivin（英國(guó)Abcam公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺癌細(xì)胞ASPC-1接種于RPMI 1640培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、1% L-谷氨酰胺，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT

鋪板，消化，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ASPC-1細(xì)胞，5%RPMI 1640培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以5 000/μL密度接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后，分為5組并加藥。吉西他濱單藥組：分別加入1、12.5、25、50、200、400 μg/mL的吉西他濱；香菇多糖單藥組：分別加入1、10、20、40、80、160、320 μg/mL的香菇多糖；吉西他濱+香菇多糖聯(lián)合用藥組：加入吉西他濱和香菇多糖的濃度分 別1 μg/mL和1 μg/mL、12.5 μg/mL和10 μg/mL、25 μg/mL和20 μg/mL、50 μg/mL和40 μg/mL、100 μg/mL和80 μg/mL、200 μg/mL和160 μg/mL、400 μg/mL和320 μg/mL。每個(gè)濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（不加細(xì)胞，加入等量的培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照組（加入等量0.1% DMSO溶液）。5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24和48 h。之后每孔加25 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸凈培養(yǎng)液加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使生成的紫色結(jié)晶充分溶解。孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm的吸光值，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率，抑制率（%）=1-（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)

將細(xì)胞分為4組：吉西他濱單藥組（吉西他濱濃度為24 h時(shí)的IC50，即50 μg/mL）、香菇多糖單藥組（香菇多糖濃度為80 μg/mL）、吉西他濱+香菇多糖聯(lián)合用藥組（吉西他濱濃度為50 μg/mL，香菇多糖濃度為80 μg/mL），同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組（加入等體積PBS）。培養(yǎng)過(guò)夜，常規(guī)消化收集細(xì)胞，稀釋至1.5×105/mL的細(xì)胞懸液，6孔板中每孔加入l mL細(xì)胞懸液，予以藥物干預(yù)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，收集各組培養(yǎng)液，胰酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次（1 000 r/min離心5 min）。用200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻間隔4 min后，加入10 μL PI（20 μg/mL）染液，室溫避光孵育10 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況（激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，吸收波長(zhǎng)630 nm）。

1.5 Western blotting

細(xì)胞分為4組：吉西他濱單藥組（吉西他濱濃度為50 μg/mL）；香菇多糖單藥組（香菇多糖濃度為80 μg/mL）；吉西他濱+香菇多糖聯(lián)合用藥組（吉西他濱濃度為50 μg/mL，香菇多糖濃度為80 μg/mL）；陰性對(duì)照組（加入等體積PBS）。經(jīng)藥物處理24 h后提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣量20 μg，1∶1加入上樣緩沖液后SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)移3 h至PVDF膜，放入封閉液中37 ℃封閉1 h，加入一抗（1∶2 000稀釋）4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后，二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶20 000稀釋）孵育1 h；化學(xué)發(fā)光后顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)；率的兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同濃度吉西他濱和香菇多糖對(duì)ASPC-1細(xì)胞作用24和48 h時(shí)的抑制率Fig.1 Inhibitory rate of different concentrations of gemcitabine and lentinan on ASPC-1 cells at 24 and 48 h

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞增殖抑制率

吉西他濱單藥組和香菇多糖單藥組中，藥物作用24、48 h后，ASPC-1細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制。吉西他濱單藥組中，吉西他濱濃度為50 μg/mL時(shí)，24和48 h時(shí)ASPC-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為48.3%和53.5%，呈時(shí)間依賴性。見(jiàn)圖1A。香菇多糖單藥組中，香菇多糖濃度為40 μg/mL時(shí)，24和48 h時(shí)ASPC-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為31.3%和39.9%，呈時(shí)間依賴性。但當(dāng)香菇多糖濃度達(dá)到80 μg/mL以上，繼續(xù)增加藥物濃度，抑制作用無(wú)明顯增強(qiáng)，320 μg/mL時(shí)的抑制率與80 μg/mL比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。見(jiàn)圖1B。吉西他濱+香菇多糖聯(lián)合用藥組ASPC-1增殖抑制率明顯上升，與吉西他濱單藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 吉西他濱、香菇多糖單藥與二者聯(lián)合用藥對(duì)ASPC-1細(xì)胞的抑制率Fig.2 Inhibitory rate of gemcitabine and lentinan alone and the combination of the two drugs on ASPC-1 cells

2.2 Annexin-V FITC/PI雙標(biāo)記染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

使用Annexin-V FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，流式細(xì)胞術(shù)所得的FITC/PI熒光雙染散點(diǎn)圖中，左下象限（Q3）為正常細(xì)胞，Annexin-V FITC（-）、PI（-）；左上象限（Q1）為壞死細(xì)胞Annexin-V FITC（-）、PI（+）；右上象限（Q2）為晚期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞，Annexin-V FITC（+）、PI（+）；右下象限（Q4）為早期凋亡細(xì)胞，Annexin-V FITC（+）、PI（-）。以Q2+Q4細(xì)胞數(shù)計(jì)算各組凋亡率，陰性對(duì)照組為（9.07±0.82）%，香菇多糖單藥組為（15.41±2.30）%，吉西他濱單藥組為（33.12±3.90）%，吉西他濱+香菇多糖聯(lián)合用藥組為（50.41±3.32）%。吉西他濱+香菇多糖聯(lián)合用藥組ASPC-1細(xì)胞的凋亡率高于吉西他濱單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖3。

2.3 Western blotting檢測(cè)凋亡抑制蛋白survivin表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，藥物處理后survivin 蛋白表達(dá)均有不同程度下降；吉西他濱+香菇多糖聯(lián)合用藥組較吉西他濱單藥組survivin 蛋白表達(dá)下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖4。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V FITC/PI雙染法檢測(cè)ASPC-1細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Flow cytometry Annexin-V FITC/PI double staining assay for apoptosis of ASPC-1 cells

圖4 ASPC-1細(xì)胞處理24 h后凋亡抑制蛋白survivin的表達(dá)Fig.4 Expression of the apoptosis inhibitory protein，survivin，in ASPC-1 cells after 24 h

3 討論

目前胰腺癌的化學(xué)治療仍以吉西他濱為首選，但晚期腫瘤患者預(yù)后差，治療反應(yīng)率低［10］。因此，尋求有效的聯(lián)合治療方案是亟待解決的研究重點(diǎn)。目前，各種免疫治療、生物治療均在嘗試階段，尚未形成共識(shí)。香菇多糖是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗腫瘤輔助藥物，從香菇子實(shí)體或菌絲中提取，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)作用。研究證實(shí)，香菇多糖能夠通過(guò)刺激機(jī)體的免疫器官、促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖分化、增加自然殺傷細(xì)胞活性、在基因和分子層次上促進(jìn)免疫功能的表達(dá)，以恢復(fù)機(jī)體的免疫功能和腫瘤微環(huán)境中的免疫平衡。香菇多糖還是一種T細(xì)胞激活劑，進(jìn)入人體后能促進(jìn)T細(xì)胞增殖，增加白細(xì)胞介素的釋放，誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生具有免疫活性的細(xì)胞因子，增強(qiáng)體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用。香菇多糖還能促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的活性，增強(qiáng)抗體依賴的細(xì)胞毒作用，發(fā)揮抗腫瘤作用［11-12］。目前，香菇多糖主要是作為一種免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于臨床，對(duì)胃癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肺癌等具有明顯療效［13-17］，也有研究［18］報(bào)道其用于進(jìn)展期胰腺癌有效，但經(jīng)驗(yàn)依舊匱乏。ZHANG等［19］報(bào)道香菇多糖在改善生活質(zhì)量以及在癌癥治療期間促進(jìn)化學(xué)療法和放射療法的療效中具有堅(jiān)實(shí)作用，可能的作用機(jī)制包括通過(guò)多種信號(hào)通路（如TLR4/Dectin1-MAPK和Syk-PKC-NF-κB通路）激活免疫細(xì)胞。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者報(bào)道，香菇多糖輔助化療治療晚期結(jié)直腸癌的療效顯著，能有效改善患者免疫功能，還能有效控制轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)及新生血管形成。這些研究證明香菇多糖可明顯改善免疫功能，提高生活質(zhì)量，并且安全，無(wú)明顯不良反應(yīng)，是一種良好的免疫佐劑。

本研究探討了吉西他濱聯(lián)合香菇多糖對(duì)人轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞ASPC-1的增殖抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合使用時(shí)對(duì)ASPC-1細(xì)胞的抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用明顯增強(qiáng)，凋亡抑制蛋白survivin表達(dá)下降，聯(lián)合用藥效果優(yōu)于吉西他濱單藥治療。香菇多糖可以作為一種輔助治療藥物用于胰腺癌的治療，對(duì)吉西他濱起到增效、增敏的作用，從而改善抗腫瘤治療效果，但具體作用機(jī)制尚不完全明確。且大樣本臨床研究結(jié)果仍然匱乏，相信隨著研究的不斷深入，其作用機(jī)制和治療效果會(huì)被逐漸揭曉。