于冬冬，趙丹陽，楊鶇祥，楊關(guān)林

（1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨科，沈陽 110032；2.沈陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110041；3.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科，沈陽 110032）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopasal osteoporosis，PMOP）是最常見的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。在PMOP的發(fā)病過程中，破骨細胞過度活化同時伴隨過度骨吸收［1］。臨床目前應(yīng)用的防治PMOP藥物都存在一定程度的不良反應(yīng)，而且沒有一種抗骨質(zhì)疏松藥物能夠完全恢復(fù)丟失的骨量［2］。

他汀類藥物是臨床治療高脂血癥的常用藥物［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物影響破骨細胞的分化及骨吸收，但具體的作用機制尚不明確。本研究試圖闡明辛伐他汀對破骨細胞分化調(diào)節(jié)及其潛在機制，為臨床防治PMOP提供新思路及研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：小鼠單核/巨噬細胞RAW264.7（美國ATCC公司）。

1.1.2 試劑：辛伐他?。⊿imvastatin，SIM，美國Sigma公司。溶于無水乙醇，儲存濃度10-2mol/L，-20℃保存）；重組人可溶性RNAK配體（recombinant human soluble RANK Ligand，sRANKL，美國Peprotech公司）；重組人巨噬細胞集落刺激因子（recombinant human macrophage colony stimulating factor，M-CSF，美國Peprotech公司）；DMEM（美國Hychone公司）；胎牛血清（美國Hychone公司）；TRAP染色試劑盒（美國Sigma公司）；核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）免疫熒光檢測試劑盒（中國Beyotime公司）；WST-1檢測試劑盒（中國Beyotime公司）；p65、p-p65一抗（美國Cell signaling公司）；鬼筆環(huán)肽檢測試劑（美國AAT BiBe Questy公司）。

1.1.3 儀器：細胞孵箱（美國Thermo公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；免疫熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；AMR-100酶標儀（中國杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠單核/巨噬細胞RAW 264.7培養(yǎng)及誘導分化：RAW 264.7細胞在DMEM未分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)（含10%胎牛血清、不含抗生素、37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，注意調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，寧偏酸性勿堿性）。細胞接種于10 cm2培養(yǎng)板內(nèi)，細胞傳代可用胰酶，但一定要注意控制胰酶消化的時間。也可以用無菌槍頭把細胞從貼壁的狀態(tài)直接吹打成懸浮細胞。誘導分化培養(yǎng)基（DMEM、10%胎牛血清、15 ng/mL sRANKL、15 ng/mL M-CSF）繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.2.2 WST-1檢測細胞增殖活性：研究分為對照組、10-5～10-9mol/L的SIM組。細胞以5×103/孔平鋪于96孔平板中，24 h后更換誘導分化培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，細胞經(jīng)SIM處理3、12、24、48 h，每孔加20 μL WST-1檢測劑。在孵箱中孵育1 h。450 nm讀取吸光度值。光密度（optical delnsity，OD）值=（處理后細胞OD值-對照組細胞OD值/N），n＞ 3。

1.2.3 TRAP染色檢測破骨細胞分化：誘導分化培養(yǎng)基中加入不同濃度的sRANKL+M-SCF（0、5 ng/mL、15 ng/mL、50 ng/mL）誘導分化 7 d。TRAP染色根據(jù)Sigma試劑盒進行操作。分析SIM對成骨細胞分化影響的分析共分5組，分別為A組（對照組）、B組（sRANKL+M-SCF組）、C組（SIM+sRANKL+M-SCF組）、D組（PDTC+sRANKL+M-CSF）、E組（SIM+PDTC+sRANKL+M-CSF）。RAW264.7細胞（5×104/孔）在24孔板內(nèi)培養(yǎng)，在含和不含SIM（10-6mol/L）的條件下進行誘導分化培養(yǎng)及藥物干預(yù)。

1.2.4 肌動蛋白檢測破骨細胞吸收活性：吸收活性檢測分為4組。A組（對照組）、B組（sRANKL+MSCF組）、C組（SIM+sRANKL+M-SCF組）和D組（PDTC+sRANKL+M-CSF組）。RAW264.7細胞（5×104細胞/孔）在24孔板內(nèi)培養(yǎng)，在含和不含SIM（10-6mol/L）的條件下誘導分化7 d。用免疫固定液在室溫下固定15 min，用免疫洗滌液（含0.1%的Triton X-100）在冰上沖洗3 min后，用鬼筆環(huán)肽檢測試劑染色40 min，用DAPI溶液染色細胞核5 min。使用共焦顯微鏡拍照。使用濾光器鬼筆環(huán)肽檢測試劑（激發(fā)：492 nm；發(fā)射：518 nm）。

1.2.5 免疫熒光檢測NF-κB核轉(zhuǎn)位：免疫熒光檢測共分為4組。A組（對照組）、B組（sRANKL+M-SCF組）、C組（SIM+sRANKL+M-SCF組）、D組PDTC+sRANKL+M-CSF組。細胞在蓋玻片上并培養(yǎng)過夜，在含和不含SIM（10-6mol/L）的條件下誘導分化7 d。細胞固定后，用p-p65抗體孵育細胞（以1 ∶400的比例稀釋）過夜，用DAPI染色細胞核（5 min），免疫熒光顯微鏡檢測。

1.2.6 Western blotting檢測：分別用sRANKL+M-SCF和SIM+sRANKL+M-SCF進行處理。細胞在含和不含SIM（10-6mol/L）的條件下誘導分化7 d。提取蛋白，定量，上樣，蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育過夜，二抗標記，ECL發(fā)光法曝光成像。Image J軟件測定平均灰度值，與內(nèi)參值進行標準化后進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 SIM抑制RAW264.7細胞增殖活性

采用WST-1方法對RAW264.7細胞增殖活性進行檢測，結(jié)果顯示，SIM（10-5mol/L、10-6mol/L）均能抑制破骨細胞的增殖活性，但是SIM（10-6mol/L）作用24 h、48 h能穩(wěn)定抑制RAW264.7細胞的增殖活性。因此，SIM（10-6mol/L）作用24 h作為實驗用藥濃度及作用時間。見表1。

2.2 破骨細胞的形態(tài)學觀察

未分化的RAW264.7細胞呈圓形，透光度好，邊界清晰。加入誘導液后，細胞觸角逐漸增多，細胞略呈短梭形，細胞透光度下降，繼而細胞融合成巨大的多核破骨細胞（細胞核數(shù)≥3）（B組破骨細胞數(shù)量44%±0.15%），加入SIM（C組破骨細胞數(shù)量18%±0.12%，P=0.004）及PDTC（D組破骨細胞數(shù)量33%±0.23%，P=0.034）后，破骨細胞的分化受到抑制，融合的破骨細胞數(shù)量明顯減少，SIM+PDTC組（E組破骨細胞數(shù)量21%±0.12%，P=0.064）的作用效果與單獨SIM組及PDTC相似。見圖1。

表1 SIM對RAW264.7細胞增殖活性的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of SIM on RAW264.7 cell proliferation（±s，n=6）

表1 SIM對RAW264.7細胞增殖活性的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of SIM on RAW264.7 cell proliferation（±s，n=6）

1）compared with control group，P ＜ 0.05.

2.3 TRAP染色檢測破骨細胞分化

圖1 SIM抑制破骨細胞形成 ×200Fig.1 SIM inhibited osteoclast formation ×200

TRAP檢測不同濃度的sRANKL+M-CSF對破骨細胞分化的影響，RAW264.7細胞在不同濃度的sRANKL+M-CSF誘導分化7 d，結(jié)果按破骨細胞數(shù)（細胞核數(shù)≥3）/總細胞數(shù)來確定破骨細胞的分化效果。對照組沒有破骨細胞分化，5 ng/mL 組為8%±0.15%，15 ng/mL 組為40%±1.5%，而50 ng/mL組為。其中，濃度為15 ng/mL組的sRANKL+M-CSF具有最大的誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化的效果。因此，將濃度為15 ng/mL的sRANKL+M-CSF誘導分化7 d作為本研究誘導分化的濃度及時間。見圖2。

2.4 SIM抑制破骨細胞的分化

RAW264.7細胞在15 ng/mL的sRANKL+M-CSF誘導分化7 d，結(jié)果按破骨細胞數(shù)核細胞）/總細胞數(shù)確定破骨細胞的分化效果，在誘導分化培養(yǎng)基中單獨加入SIM（10-6mol/L，C組破骨細胞數(shù)為18%±0.12%）及PDTC（10-5mol/L，D組破骨細胞數(shù)為35%±0.13%，B組破骨細胞數(shù)為48%±0.25%）和SIM+PDTC（20%±0.11%）的情況下，破骨細胞的分化受到抑制，SIM+PDTC組的一致分化效果與單獨SIM組及PDTC相似（P＞ 0.05）。見圖3。

圖2 不同濃度的sRANKL+M-CSF誘導破骨細胞分化 ×200Fig.2 Osteoclast differentiation induced by different concentrations of sRANKL+M-CSF ×200

2.5 SIM抑制破骨細胞肌動蛋白環(huán)的形成

圖3 SIM抑制破骨細胞的分化 ×200Fig.3 SIM inhibits osteoclast differentiation ×200

用熒光顯微鏡檢測肌動蛋白環(huán)，以觀察成熟的破骨細胞肌動蛋白環(huán)的結(jié)構(gòu)。sRANKL+M-CSF能夠誘導明顯誘導肌動蛋白環(huán)的形成（B組：41%±0.15%），SIM能夠抑制肌動蛋白環(huán)的形成（C組：10%±0.08%），加入PDTC后的作用效果與SIM相似（D組：11%±0.13%）。見圖4。

2.6 SIM抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，破骨細胞分化后，p65向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，SIM能夠抑制其向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位。見圖5。

圖4 SIM抑制破骨細胞肌動蛋白環(huán)的形成Fig.4 SIM inhibits actin ring formation in osteoclasts

2.7 Westerm blotting結(jié)果

進一步分析SIM抑制成骨細胞分化的潛在機制，免疫印跡檢測通路蛋白顯示，sRANKL+MCSF能促進細胞核內(nèi)p65的磷酸化（0 min，5 min，30 min，60 min），尤以60 min時p65磷酸化明顯，加入SIM后p65的細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位受到抑制，60 min時抑制效果明顯，提示SIM發(fā)揮其抑制破骨細胞分化的藥效學機制是通過抑制NF-κB信號通路完成的（P＜0.05）。見圖6。

圖5 SIM抑制p65細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位Fig.5 SIM inhibits intranuclear translocation of p65 in cells

圖6 SIM抑制p65磷酸化Fig.6 SIM inhibits p65 phosphorylation

3 討論

PMOP與雌激素缺乏密切相關(guān)，具有骨質(zhì)疏松癥的一般特征，如骨小梁結(jié)構(gòu)破壞和骨折風險增加［5］。研究［6-8］表明，雌激素能抑制破骨細胞的形成。在PMOP的發(fā)病過程中，過度激活破骨細胞形成和過度骨吸收是一個重要的因素，因此，抑制破骨細胞分化仍是PMOP治療的一個重要策略。

他汀類藥物具有抗血栓、抗氧化和抗炎和多效性的治療作用。研究［9］表明，他汀類藥物對骨骼具有一定的藥理學作用。還有研究［10-11］表明，他汀類藥物增加了卵巢切除的骨形成、抑制破骨細胞生成，但其潛在機制尚不清楚。

本研究揭示了辛伐他汀抑制破骨細胞分化的潛能，TRAP染色檢測顯示，辛伐他汀抑制sRANKL和M-CSF誘導的RAW264.7細胞向破骨細胞的形成和分化。破骨細胞形成過程中，細胞骨架重排導致肌動蛋白環(huán)的形成。這些肌動蛋白環(huán)在維持細胞結(jié)構(gòu)中起著至關(guān)重要的作用［12］。F-肌動蛋白環(huán)檢測結(jié)果表明，辛伐他汀能夠抑制破骨細胞吸收活性，這對預(yù)防和治療PMOP具有重要意義。

NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)破骨細胞成熟、分化、凋亡的重要通路［13］，進一步研究辛伐他汀發(fā)揮抑制破骨細胞分化的潛在機制。結(jié)果顯示，辛伐他汀抑制NF-κB通路的核心蛋白p65的激活，抑制p65的細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，進而抑制破骨細胞的分化。因此，本研究為臨床應(yīng)用辛伐他汀防治PMOP提供了依據(jù)。