王金才 余鴿 劉喚明

摘 要：本研究采用紫外線誘變育種的方法，選育耐高溫蛋白酶高產(chǎn)菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過牛奶平板初篩和酶活測定復(fù)篩，得到菌株A2的酶活為525.56U/mL，與初始菌株相比，其酶活提高了34.26%。菌株A2經(jīng)過5次代傳酶活力在519.12～538.23U/mL之間，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：耐高溫蛋白酶;紫外誘變;地衣芽孢桿菌

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200330004

蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中。蛋白酶是酶學(xué)研究中最早也是最深入的一種酶，到21世紀(jì)初已經(jīng)報(bào)道的蛋白酶超過900種[1]。蛋白酶在洗滌、紡織、釀造、化工、環(huán)保、食品和飼料等行業(yè)都得到了廣泛應(yīng)用，是一種非常重要的商業(yè)化酶制劑，其市場份額占酶制劑市場的首位。耐高溫蛋白酶具有很好的熱穩(wěn)定性，在許多領(lǐng)域顯示出更好的應(yīng)用前景，已成為國內(nèi)外蛋白酶研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

國內(nèi)對耐高溫蛋白酶進(jìn)行了大量的研究，尹春筱[2]等從云南騰沖熱泉中分離出產(chǎn)耐高溫蛋白酶的嗜熱芽孢桿菌;廉立慧[3]等從溫泉中篩選出產(chǎn)耐高溫蛋白酶的短芽孢桿菌;王麗[4]等從酒曲中分離出產(chǎn)耐高溫蛋白酶的芽孢桿菌;母智深[5]等以乳粉為樣品篩選出產(chǎn)耐高溫蛋白酶的熒光假單孢桿菌。盡管國內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量的產(chǎn)耐高溫蛋白酶的菌株，但以上菌株產(chǎn)酶能力不強(qiáng)。因此，選育耐高溫蛋白酶高產(chǎn)菌株對耐高溫蛋白酶的生產(chǎn)應(yīng)用具有重要價值。

本團(tuán)隊(duì)從湛江湖光巖瑪珥湖地區(qū)篩出1株產(chǎn)耐高溫蛋白酶的地衣芽孢桿菌HL-3，所產(chǎn)耐高溫蛋白酶的最適作用溫度為70℃，最適pH為7.0，在90℃環(huán)境保溫10min后酶活力仍可保留75.12%[6]。本文以上述菌株為研究基礎(chǔ)，通過紫外誘變的方法選育高產(chǎn)菌株，以期為耐高溫蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1菌種

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）HL-3，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院微生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑與原材料

豆粕購買于廣州億永糧油集團(tuán)有限公司，粉碎后過60目篩備用;奶粉為澳大利亞德運(yùn)脫脂奶粉;福林酚試劑購于上海聯(lián)邁生物工程有限公司;其它常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化鈉5g、葡萄糖1g、蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化鈉5g、葡萄糖1g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。

牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉10g、瓊脂2g、蒸餾水100mL，100℃滅菌10min。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：豆粕10g、葡萄糖0.5g、蒸餾水100mL，121℃滅菌20min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 蛋白酶酶活測定方法

按李嬋娟等的方法[7]進(jìn)行，用pH為7.0的緩沖液，反應(yīng)溫度為50℃。酶活單位定義：1mL酶液在特定條件下每分鐘水解酪蛋白溶液生成1μg酪氨酸所需要的酶量定義為1個酶活單位U。

配制500μg/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后將此標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋到濃度為0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL。分別取上述稀釋液各1mL加入到試管中，然后往每只試管加0.5%酪蛋白溶液2mL，放入50℃水浴中保溫20min，再加入10%三氯乙酸3mL，混勻;將每個試管都倒入濾紙中進(jìn)行過濾，收集濾液;取濾液1mL于1支試管中，然后再加0.55mol/LNa2CO3溶液5mL和福林酚試劑1mL，放入50℃水浴中顯色15min;用不含酪氨酸溶液的試劑作為對照，在680nm波長下測定吸光度;以吸光值為橫坐標(biāo)，酪氨酸的質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將發(fā)酵液于8000r/min離心10min，收集上清液作為粗酶液，然后將粗酶液用蒸餾水稀釋到合適的倍數(shù);各取1mL稀釋后的粗酶液分別置于2支試管中，1支作為待測管，另1支為對照管。將待測管和裝0.5%酪蛋白溶液的試劑瓶都置于50℃水浴鍋中預(yù)熱10min，然后將0.5%酪蛋白溶液加2mL到待測管中，于50℃水浴鍋中繼續(xù)保溫20min;取出后向待測管中加入10%的三氯乙酸3mL，混勻;將待測管倒入濾紙中進(jìn)行過濾，收集過濾液。取1mL過濾液放入1支新試管中，再加5mL0.55mol/LNa2CO3溶液和1mL福林酚試劑，放入50℃水浴鍋中顯色15min。對照管的操作方法同待測管，只是在加酪蛋白之前先加10%的三氯乙酸3.0mL，使其酶失活，再加入酪蛋白。用對照管調(diào)零，并在680nm波長下測定吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)來計(jì)算蛋白酶的酶活。

1.4.2 菌株紫外誘變的方法

將斜面保藏的地衣芽孢桿菌HL-3接種于盛有30mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于50℃恒溫?fù)u床中，120r/min培養(yǎng)16h;然后于5000r/min離心10min，棄去上清液，打勻沉淀，加入生理鹽水，稀釋為細(xì)胞濃度約為108CFU/mL的菌懸液。

先將紫外燈進(jìn)行預(yù)熱30min，然后將3mL制備的菌懸液加入到無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，開啟培養(yǎng)皿蓋后，在磁力攪拌的條件下，紫外線照射分別為0s、30s、60s、90s、120s和150s，每個處理重復(fù)3次。

在暗室紅燈下將紫外線處理后的菌懸液用無菌水進(jìn)行10倍稀釋至合適的稀釋度，然后涂布于牛奶培養(yǎng)基上;將所有培養(yǎng)皿用黑色紙包扎，于50℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。計(jì)算不同照射時間下的致死率，觀察并測量對照組和處理組的菌落透明圈，測定透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），計(jì)算兩者的比值。選取D/d較大的菌落菌株轉(zhuǎn)接到營養(yǎng)斜面培養(yǎng)基上，于50℃培養(yǎng)24h作為初篩菌種;將初篩挑選的菌株挑取一環(huán)接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，裝液量為30mL/250mL，于50℃、120r/min振蕩培養(yǎng)24h后測定發(fā)酵液的酶活，篩選出酶活最高的菌株作為所篩菌株。

1.4.3 致死率的測定

紫外線物理誘變后菌株的致死率計(jì)算公式[8]如下：

致死率（%）=[（未誘變平板菌落數(shù)-誘變后平板菌落數(shù)）/未誘變平板菌數(shù)]×100

1.4.4 選育菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將最終篩選的高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行5次遺傳代傳，依次接種一環(huán)至產(chǎn)酶發(fā)培養(yǎng)基中，裝液量為30mL/250mL，于50℃、120r/min振蕩培養(yǎng)24h后測定各代傳的耐高溫蛋白酶活力。通過比較不同代傳的酶活力，判斷其高產(chǎn)酶特性能否穩(wěn)定地遺傳。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外照射時間對致死率的影響

對誘變菌株的每個紫外照射時間的致死率進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表1所示。由表1結(jié)果可知，隨著紫外照射時間的增加，誘變菌株的致死率不斷增加，這與薛健[9]等的研究一致。

2.2 紫外誘變篩選結(jié)果

通過紫外照射共篩選得到108株突變菌株，在這108株突變菌株中，根據(jù)D/d值的大小篩選出其值較大的4株作為初篩菌株，并將初篩進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩，結(jié)果如表2所示。由表2結(jié)果可知，菌株A2的蛋白酶酶活最高，為525.56U/mL;菌株A1、A3和A4所產(chǎn)蛋白酶分別為502.36U/mL、512.33U/mL和508.72U/mL;而作為對照的初始菌株A0所產(chǎn)蛋白酶酶活為391.25U/mL;菌株A2與初始菌株相比，其酶活提高了34.26%。

2.3 高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

菌株A2不同遺傳代數(shù)的耐高溫蛋白酶酶活如圖1所示。由圖1結(jié)果可知，A2經(jīng)過5次代傳酶活力在519.12～538.23U/mL之間，酶活力波動范圍在2%以內(nèi)，表明該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以地衣芽孢桿菌HL-3為初始菌株，通過紫外誘變篩選得到菌株A2，其酶活為525.56U/mL，與初始菌株相比，酶活提高了34.26%。菌株A2經(jīng)過5次代傳酶活力在519.12～538.23U/mL之間，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)

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[2]尹春筱，李江，徐玲玲.一株產(chǎn)高溫蛋白酶嗜熱菌A-2的篩選鑒定及酶學(xué)特性分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2019，38（7）：3051-3056.

[3]廉立慧，高麗君，王德才，等.高溫蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及其產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)分析[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011（3）：175-179.

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[5]母智深，白英.原料乳中產(chǎn)耐高溫蛋白酶菌株的篩選與鑒定[J].中國乳品工業(yè)，2009，37（10）：24-26.

[6]劉喚明，張芷欣，洪鵬志，等.耐高溫蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)特性的初步研究[J].食品工業(yè)科技，2017，38（3）：133-136.

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[8]趙斌，何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：科學(xué)出版社，2002：187-191.

[9]薛健，王歡.納豆激酶生產(chǎn)菌的紫外誘變選育[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2016，36（21）：4-5.

（責(zé)任編輯 李媛媛）