曹訪　劉莉　采克俊　吳成龍　周俊波

摘要：采用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序方法，比較分析幼齡翹嘴紅鲌精巢、卵巢組織中小RNA轉(zhuǎn)錄譜。結(jié)果顯示，精巢、卵巢的小RNA分布的峰值分別為28、29 nt，與一般物種的22～24 nt有較大的差異;在小RNA庫(kù)中，經(jīng)比對(duì)注釋的比例很低，分別為2.5%、2.1%。在比對(duì)注釋的斑馬魚(yú)miRBase、斑馬魚(yú)ncRNA、piRNA、Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)中，精巢組織中被miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的比例最高，為1.49%;而卵巢組織中被miRBase和piRNA數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的比例接近，分別為094%和0.96%。比較表達(dá)量相對(duì)較高的共有miRNA分子，均是與胚胎發(fā)育相關(guān)的分子，且大多是精巢組織的表達(dá)量高于卵巢組織，這些miRNA分子在個(gè)體發(fā)育中可能具有重要意義。初步獲得了翹嘴紅鲌不同性腺組織的轉(zhuǎn)錄譜，為今后進(jìn)一步分析小RNA在生殖發(fā)育中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：翹嘴紅鲌;精巢;卵巢;miRNA;轉(zhuǎn)錄譜;分析;比較

中圖分類號(hào)： S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0077-06

收稿日期：2018-10-17

作者簡(jiǎn)介：曹 訪（1980—），男，江蘇豐縣人，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：hzyzucf@hotmail.com。

生物體內(nèi)的小分子非編碼RNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)形成遺傳信息的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在細(xì)胞的分裂分化、個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等生命活動(dòng)過(guò)程中具有重要的作用。已發(fā)現(xiàn)的這類小RNA包括siRNA（small interfering RNA）、miRNA（microRNA）、hsRNA（heterochromatin associated small RNA）和piRNA（piwi interacting RNA）等。發(fā)掘新的小分子非編碼RNA、研究其生物學(xué)功能及作用機(jī)制在生命科學(xué)研究中具有重要意義，目前研究較多的是miRNA。魚(yú)類的miRNA也已在斑馬魚(yú)、紅鰭東方鲀等幾個(gè)模式種以及非模式魚(yú)類的虹鱒魚(yú)中被發(fā)現(xiàn)報(bào)道[1-2]。

miRNAs是一類非編碼、長(zhǎng)度約22 nt的小RNA分子，由60～80 nt的莖環(huán)前體分子衍生而來(lái)，廣泛存在于動(dòng)物、植物甚至病毒中。miRNAs通過(guò)調(diào)節(jié)靶標(biāo)mRNAs的穩(wěn)定性和翻譯效率，在基因的表達(dá)中起著非常重要的作用，影響著各個(gè)生理過(guò)程，包括代謝、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、免疫防御、腫瘤病理過(guò)程等。自從1993年首次在秀麗線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)miRNA（lin-4）以來(lái)[3]，有大量關(guān)于miRNAs的生物合成、功能和作用機(jī)制的研究[4-6]。盡管miRNAs的作用早已發(fā)現(xiàn)，但有關(guān)miRNA轉(zhuǎn)錄組的研究最近幾年才開(kāi)始。過(guò)去主要是通過(guò)直接克隆、測(cè)序、northern blot雜交分析等鑒定逐個(gè)對(duì)miRNAs鑒定。但這一方法對(duì)于含量較低的、表達(dá)水平變化幅度大的、瞬時(shí)表達(dá)的、與不同發(fā)育階段相關(guān)的miRNAs的分析具有很大的局限性。這也解釋了小規(guī)模測(cè)序主要揭示保守miRNAs分子，而對(duì)于低水平的非保守miRNAs卻難以分析，高通量測(cè)序方法使非保守的、弱表達(dá)的、種特異性的miRNAs的分析成為可能。piRNAs是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小RNA，具有組織特異性，調(diào)控著生殖細(xì)胞和干細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)物種的遺傳和維持至關(guān)重要，已在人、果蠅、斑馬魚(yú)等動(dòng)物的生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了這類小分子[7-9]。

現(xiàn)有的魚(yú)類生殖發(fā)育研究主要集中在斑馬魚(yú)、青鳉魚(yú)等模式物種上，而養(yǎng)殖魚(yú)類相關(guān)研究甚少，其原因與相關(guān)遺傳背景是否清楚有關(guān)。但魚(yú)類屬低等脊椎動(dòng)物，物種差異大，其生殖發(fā)育復(fù)雜多樣，對(duì)模式生物的研究成果難以套用到養(yǎng)殖品種中。我國(guó)作為水產(chǎn)大國(guó)，很多研究者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這一點(diǎn)。翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaeformis）是一種鯉科淡水魚(yú)類，分布較為廣泛，俗稱白魚(yú)，長(zhǎng)江下游俗稱“太湖白魚(yú)”，是“太湖三白”之一。其肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，是魚(yú)中上品，市場(chǎng)價(jià)格較高。天然水域的生產(chǎn)量已很低，野生資源日益減少。目前已建立了翹嘴紅鲌的人工繁殖技術(shù)和大規(guī)模的人工養(yǎng)殖技術(shù)。筆者前期的初步研究發(fā)現(xiàn)，雌性翹嘴紅鲌的卵巢發(fā)育較雄性精巢發(fā)育早，其生長(zhǎng)也較早。針對(duì)這一名優(yōu)特色魚(yú)種開(kāi)展生殖細(xì)胞的基礎(chǔ)生物學(xué)研究，對(duì)于品種進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用及保護(hù)天然翹嘴紅鲌的野生資源等都有重要的意義。本研究選取幼齡翹嘴紅鲌的性腺開(kāi)展了小RNA轉(zhuǎn)錄組的分析比較，為今后進(jìn)一步開(kāi)展生殖細(xì)胞發(fā)育及性別調(diào)控研究等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織收集與總RNA制備

分別取5月齡的3尾雌性及3尾雄性翹嘴紅鲌的性腺組織各1 g，迅速在液氮中速凍。研磨后，分別將3尾雌魚(yú)和3尾雄魚(yú)的組織樣品混合，用TRIzol reagent（Life Technologies公司）試劑提取總RNA。提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)、1%瓊脂糖電泳和Agilent BioAnalyzer 2100進(jìn)行質(zhì)檢（安捷倫科技有限公司）。

1.2 小RNA文庫(kù)的建立

采用miRNA提取試劑盒mirVanaTM miRNA isolation kit（Ca#t.AM1560 Austin TX，Thermo Fisher，US）從上述提取的總RNA中富集小RNA。之后，先在小RNA的5′和3′末端添加1對(duì)接頭序列，再用于接頭互補(bǔ)的序列作為引物進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增的cDNA經(jīng)6% PAGE膠純化后，使用Qubit 2.0 Fluorometer檢測(cè)濃度，Agilent2100檢測(cè)文庫(kù)的大小。由測(cè)序儀Illumina Genome Analyzer GA-IIX（Illumina公司）進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序質(zhì)量要求每向堿基質(zhì)量大于20（Q20）的比例不小于85%。

1.3 生物信息學(xué)分析

原始的測(cè)序數(shù)據(jù)以去除低質(zhì)量讀長(zhǎng)以及將含接頭序列且大于18 nt序列為可用的讀長(zhǎng)作為數(shù)據(jù)過(guò)濾的依據(jù)，所用軟件為CLC genomic workbench（商業(yè)軟件版本號(hào)5.5）。經(jīng)過(guò)濾的small RNA序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)去除rRNA、tRNA、small nuclear RNA（snRNA）and small nucleolar RNA（snoRNA），余下的序列再與miRBase、ncRNA、piRNA、Rfam等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。此外，應(yīng)用sRNA Toolkit軟件包里的miRCat工具來(lái)預(yù)測(cè)novel miRNA;應(yīng)用miRanda軟件對(duì)miRNA序列以及所測(cè)序物種的cDNA序列進(jìn)行可能的靶位點(diǎn)預(yù)測(cè);用DEGseq R語(yǔ)言包結(jié)合perl腳本將樣品的表達(dá)量進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA制備與小RNA文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

提取精巢和卵巢混合樣品的總RNA的D260 nm/D280 nm分別為2.05和2.02，表明其純度較好。但同樣組織量精巢樣品提取的總RNA量明顯低于卵巢的總RNA提取量，且5S的量較高。推測(cè)這可能與雌魚(yú)較雄魚(yú)發(fā)育快有關(guān)。此外，Agilent BioAnalyzer 2100質(zhì)檢結(jié)果中RIN值大于8，也表明提取質(zhì)量合格。

構(gòu)建的小RNA文庫(kù)經(jīng)Qubit 2.0 Fluorometer檢測(cè)，精巢、卵巢的小RNA的cDNA文庫(kù)濃度分別為32.6、10.6 ng/μL，主峰長(zhǎng)度分別為148、149 bp（圖1）。單端測(cè)序，讀長(zhǎng)50 nt，測(cè)序所用Flow cell為Illumina Single Read Flow cell V4，測(cè)序結(jié)果顯示精巢和卵巢的Q20值的百分比分別為97.4%和976%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)可用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理與長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)

本研究采用Illumina/Solexa深度測(cè)序技術(shù)對(duì)幼齡翹嘴紅鲌的精巢和卵巢的小RNA庫(kù)進(jìn)行了測(cè)定。應(yīng)用 CLC genomics_workbench 5.5軟件對(duì)測(cè)定的數(shù)

據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，主要是棄去僅含接頭序列、低質(zhì)量序列、長(zhǎng)度小于15 nt和大于33 nt的序列等。此外，還須排除已知的mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和重復(fù)序列元件。測(cè)定的精巢小RNA原始讀長(zhǎng)（reads）為24 752 792個(gè)，可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量有效讀長(zhǎng)20 167 240個(gè)，占81.47%;卵巢小RNA的原始讀長(zhǎng)為 22 947 949 個(gè)，其中有效讀長(zhǎng)為18 198 879個(gè)，占79.31%。精巢小RNA的序列大小分布的峰值在28 nt，卵巢小RNA的峰值在29 nt（圖2）。

2.3 比對(duì)注釋，鑒定已知miRNA

上述處理后的序列與最新Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，比對(duì)過(guò)程不允許有錯(cuò)配。另外還與其他非編碼數(shù)據(jù)庫(kù)ncRNA、piRNA、Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，允許與目標(biāo)序列有2個(gè)堿基錯(cuò)配、允許比目標(biāo)序列兩端各縮短或延長(zhǎng)2個(gè)堿基。比對(duì)結(jié)果（圖3）表明，精巢的有效讀長(zhǎng)序列中，被注釋的讀長(zhǎng)有502 823個(gè)，占2.5%，其中與斑馬魚(yú)miRBase、斑馬魚(yú)ncRNA、piRNA、Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋的讀長(zhǎng)所占比例分別為 1.49%、0.87%、0.09%、0.05%;而卵巢組織中被注釋的讀長(zhǎng)有374 895個(gè)，占2.1%，被上述數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的比例分別為0.94%、0.10%、0.96%、0.07%。

用DEGseq R語(yǔ)言包結(jié)合perl腳本將精巢和卵巢樣品的表達(dá)量進(jìn)行鑒定和比較分析。2個(gè)樣品的小RNA中，有219個(gè)miRNA與斑馬魚(yú)miRBase已知miRNA相同，但其表達(dá)量有差異。其中有9個(gè)miRNA在精巢組織中可找到，在卵巢中沒(méi)有找到;有4個(gè)在卵巢中有而在精巢中沒(méi)有，但這13個(gè)miRNA的表達(dá)豐度都極低。在已知miRNA中，較高表達(dá)豐度的miRNA分子在精巢中的表達(dá)絕大部分都高于卵巢（圖4）。

2.4 新microRNA分子的預(yù)測(cè)

應(yīng)用sRNA Toolkit軟件包中的miRCat工具來(lái)預(yù)測(cè)novel miRNA。microRNA前體的標(biāo)志性發(fā)卡結(jié)構(gòu)能夠用來(lái)預(yù)測(cè)新的microRNA。將沒(méi)有注釋的讀長(zhǎng)（樣品名_unannotated.csv）比對(duì)到斑馬魚(yú)基因組后，通過(guò)折疊模型分析，若有序列位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)上，則初步判定該序列為1個(gè)候選的新microRNA。按上述方法在精巢組織中預(yù)測(cè)到76個(gè)新microRNA，卵巢組織中預(yù)測(cè)到77個(gè)，其中50個(gè)相同。預(yù)測(cè)新microRNA序列，見(jiàn)表1。在這些預(yù)測(cè)的新microRNA分子中，僅在精巢和卵巢共有序列中有4個(gè)序列具有對(duì)應(yīng)的miRNA*序列，分別是第1、第2、第30號(hào)序列，它們對(duì)應(yīng)的miRNA*序列分別為：AUGAAGGUCAAUGGUUAvCCvAGU（dre-miR-7146-3p）、GAUCAUUUUUGUGAUUAUGCAGCU（dre-miR-153c-3p）、UCACAGUGAACCGGUCUCUUUU（dre-miR-128-3p）。

3 討論

魚(yú)類養(yǎng)殖中所涉及的苗種繁育、性別控制等問(wèn)題與魚(yú)類生殖細(xì)胞的發(fā)育分化密切相關(guān)。此外，魚(yú)類屬低等脊椎動(dòng)物，其生殖發(fā)育較高等脊椎動(dòng)物具有更豐富的多樣性。結(jié)合現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)，弄清楚水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類的基礎(chǔ)生物學(xué)問(wèn)題，是進(jìn)行現(xiàn)代育種、建設(shè)現(xiàn)代漁業(yè)的重要環(huán)節(jié)。本研究就具有地方特色的名優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種翹嘴紅鲌的性腺小RNA轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了初步的分析。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，盡管筆者所用材料均為5月齡翹嘴紅鲌性腺，但通過(guò)組織切片觀察其性腺發(fā)育階段明顯不同。該階段精巢組織中還未見(jiàn)游離精子，而卵巢組織中已見(jiàn)游離的卵子;提取總RNA時(shí)也發(fā)現(xiàn)，卵巢組織總RNA中5S RNA的含量很高。目前，已有翹嘴紅鲌全雌育種技術(shù)的應(yīng)用，主要是利用雌性生長(zhǎng)較雄性快的特點(diǎn)，從其性腺的發(fā)育來(lái)看，也是雌性發(fā)育較雄性早。

從獲得的小RNA數(shù)據(jù)與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果來(lái)看，可注釋的序列比例非常低，97%以上的序列無(wú)法注釋，這一方面反映了魚(yú)類基因組信息的多樣性，另一方面也提示模式生物的遺傳信息對(duì)于魚(yú)類基因組、轉(zhuǎn)錄組等研究具有較大的局限性。在小RNA序列分布中，發(fā)現(xiàn)其峰值在28～29 nt，這一值較其他物種明顯偏高。已報(bào)道的其他物種小RNA大小分布的峰值一般在22～24 nt，也有報(bào)道在 26 nt[10]。仔細(xì)校驗(yàn)測(cè)序過(guò)程，證實(shí)其樣品制備及測(cè)序質(zhì)控均符合要求，說(shuō)明該結(jié)果與物種有關(guān)。但是否因其特殊的發(fā)育階段導(dǎo)致，還須與其他發(fā)育階段的小RNA轉(zhuǎn)錄組比較。

在被注釋的已知miRNA中，miR-181a-5p、mir-143-1、mir-92a-1、mir-26a-1、miR-146a、mir-10b-1、mir-22a、mir-21-1、mir-10c、let-7a-1等這些表達(dá)量較高的miRNA分子，均與斑馬魚(yú)的個(gè)體發(fā)育密切相關(guān)[11-12]。此外，在小RNA轉(zhuǎn)錄譜已比對(duì)注釋的分子中，精巢miRNAs所占比例最高，為1.49%，而卵巢中已注釋的miRNAs和piRNAs所占比例接近，分別為0.94%和0.96%，這可能也與同一年齡的精巢和卵巢組織實(shí)際上是處于不同的發(fā)育階段有關(guān)，其中miRNAs和piRNAs的消長(zhǎng)規(guī)律值得進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本研究采用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序方法，比較分析了幼齡翹嘴紅鲌精巢和卵巢組織中小RNA轉(zhuǎn)錄譜，由于沒(méi)有翹嘴紅鲌基因組信息，新miRNA的預(yù)測(cè)只能以斑馬魚(yú)基因組信息為基礎(chǔ)展開(kāi)。結(jié)果顯示，部分預(yù)測(cè)的同一個(gè)新miRNA分子位于不同的染色體上，由此推測(cè)這些成熟的miRNA分子在翹嘴紅鲌的基因組中也可能對(duì)不同的基因起到調(diào)控作用。下一步，筆者可繼續(xù)比較分析其他不同發(fā)育階段性腺小RNA轉(zhuǎn)錄譜，可能找出性別調(diào)控的關(guān)鍵miRNAs或piRNAs。

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