傅滟，任星宇，楊丹，鄧才富，羅舜，徐廣*

重慶市藥物種植研究所中藥材質(zhì)量控制研究中心，重慶市道地藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心（重慶 408435）

皺皮木瓜為貼梗海棠（Chɑenmeles speciosɑ Nakai）的干燥果實，主產(chǎn)于安徽宣城、重慶綦江以及湖北長陽資丘[1]。木瓜自古以來作為治病良藥，具有平肝舒筋、和胃化濕、降壓、降糖、軟化血管、護肝降酶、養(yǎng)顏抗衰、防老年癡呆、促進血液循環(huán)、延年益壽和提高人體免疫力等功效。作為藥食同源的常用中藥，含有多種對人體有益的營養(yǎng)成分和藥用成分，如多糖、有機酸、黃酮、皂苷、氨基酸、蛋白酶和維生素等[2-4]。

多糖又稱多聚糖，是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的，是具有廣泛生物活性的天然大分子化合物[5]，其廣泛分布于自然界高等植物、藻類、微生物和動物體內(nèi)。大量文獻研究表明，多糖具有多方面的生物活性與功能，具有清除自由基、降血糖、抗菌抗病毒、抗腫瘤與調(diào)節(jié)免疫等生物學(xué)功效[6-7]。近年來，多糖類物質(zhì)的研究成為科學(xué)熱點[8-13]，研究多糖在食品、醫(yī)療、保健等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

多糖為皺皮木瓜的重要成分，研究發(fā)現(xiàn)木瓜多糖具有很高的生物活性和藥用價值，可開發(fā)成功能性飲料、藥品和保健品。為皺皮木瓜的進一步研究奠定基礎(chǔ)，促進中國皺皮木瓜資源的開發(fā)利用，對皺皮木瓜多糖的提取、分離純化及其生物活性進行綜述。

1 皺皮木瓜多糖提取分離及純化

1.1 提取

多糖提取方法多樣，主要有浸提法、回流提取法、水提醇沉法、酶法、超聲波輔助、微波輔助、內(nèi)部沸騰法、多種技術(shù)聯(lián)合使用等，其中水提醇沉法為木瓜多糖提取最常見方法之一。

楊之敏等[14]以石油醚回流脫脂，以固液比1︰30（g/mL）加入蒸餾水，90 ℃浸提2次，每次2 h，合并濾液濃縮，95%乙醇4 ℃過夜醇沉，再加入Sevag試劑（V氯仿︰V正丁醇=5︰1）除蛋白，用95%乙醇4 ℃過夜，抽濾，精制皺皮木瓜多糖得率3.4%。王曉梅等[15]采用水提醇沉法提取木瓜多糖：以乙醇回流脫脂，在提取溫度90 ℃，時間2.5 h，料液比1︰50（g/mL）條件下重復(fù)3次，加入Sevag試劑除蛋白，95%乙醇、丙酮反復(fù)精制，精制皺皮木瓜多糖提取率為6.97%。乙醇回流法，上述方法均具有操作繁瑣、耗時、試驗不易處理等缺點。

酶技術(shù)是近年來用于天然植物有效成分提取的生物工程技術(shù)，選用適當(dāng)?shù)拿缚梢员容^溫和地分解植物組織，加速有效成分釋放，進而提高其提取率。陳燕等[16]采用纖維素酶法提取皺皮木瓜多糖，其通過正交試驗得其提取工藝：酶用量1.5%、提取溫度55 ℃、時間2 h、pH 4，多糖得率9.24%。同時對比不加酶、其他條件不變的情況下，多糖得率為5.23%；酶法較常規(guī)不加酶木瓜多糖的得率提高了76.67%。這可能是木瓜細(xì)胞壁的主要成分纖維素在提取過程中被纖維素酶軟化、膨脹和崩潰，從而促進了細(xì)胞的通透性，進而提高有效成分的提取量。但是酶容易失活，試驗溫度不能過高，對試驗有一定限制。

超聲或微波輔助提取技術(shù)已被廣泛用于植物有效活性成分的提取。超聲輔助提取多糖是一種物理破碎過程，利用其空化和機械振動作用破裂細(xì)胞壁，提高多糖提取率，同時還有熱效應(yīng)和乳化作用，加速有效成分溶出。徐懷德等[17]采用超聲輔助提取木瓜多糖，在較短提取時間內(nèi)，多糖提取率達(dá)到12.072%。黃鎖義等[18]以蒸餾水為提取劑，超聲提取皺皮木瓜多糖，多糖提取率達(dá)到12.81%。李寶珠等[19]采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合超聲輔助提取皺皮木瓜多糖，在較短提取時間內(nèi)，多糖提取率達(dá)到16.5%。微波輔助提取技術(shù)既能保證有效物質(zhì)的充分溶出，又能防止提取物的降解，對于一些物質(zhì)的提取效果明顯優(yōu)于其他方法。張彥慧等[20]采用響應(yīng)曲面法微波輔助提取皺皮木瓜多糖，多糖平均提取率可達(dá)60.83±2.09 mg/g，比相同條件下傳統(tǒng)水浴平均提取率50.33±2.06 mg/g高出10.5%。

超聲和微波輔助提取技術(shù)相比于傳統(tǒng)水浴提取方法有明顯的優(yōu)勢。提高多糖提取率，大大地縮短提取時間，提取工藝簡單，成本低。多種提取技術(shù)聯(lián)合使用是一大趨勢，超聲輔助聯(lián)合酶法、微波輔助聯(lián)合酶法或超聲微波同時輔助聯(lián)合酶法可能對于多糖的提取能開啟新的篇章。

1.2 分離純化

常用的提取方法所得木瓜多糖含有蛋白質(zhì)、色素等物質(zhì)，需進行分離純化。分離純化的方法有脫色、脫蛋白、大孔樹脂吸附法等。李芳等[21]利用Sevag法反復(fù)除去皺皮木瓜多糖中蛋白質(zhì)，加入乙醇，使乙醇含量達(dá)80%，攪拌，4 ℃靜置過夜，抽濾，濾渣真空干燥，得精制多糖。王曉梅等[15]利用Sevag法多次除去木瓜多糖中蛋白質(zhì)，采用多糖4倍量95%乙醇，收集沉淀，用乙醇、丙酮反復(fù)洗滌沉淀，真空干燥得精制木瓜多糖。劉捷等[22]利用Sevag法多次除去皺皮木瓜多糖中蛋白質(zhì)，用透析法去除小分子雜質(zhì)，利用Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱富集純化，得到精制木瓜多糖。姚程程等[23]利用Sevag法5次除去皺皮木瓜多糖中蛋白質(zhì)，采用氧化法除色素，經(jīng)大孔樹脂分離純化，多糖含量達(dá)89.74%。分離純化步驟冗長，耗時長，使用溶劑種類多、量大；亟需開發(fā)一種步驟簡便，耗時少，無溶劑或少溶劑的綠色可持續(xù)分離純化模式。王光寧等[24]采取星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選蛋白酶-Sevag法去除皺皮木瓜多糖中蛋白質(zhì)，去除條件為：酶解pH 7，時間89 min，溫度54 ℃，酶底質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.70%，Sevag法處理1次，多糖保留率70.04%，蛋白脫出率63.42%。該法步驟簡便，耗時少，大大減少有機溶劑使用。

2 生物活性

2.1 抗氧化活性

機體內(nèi)自由基中危害極大的·OH，可引起細(xì)胞死亡、機體衰老等危害，亟待開發(fā)有抗氧化和清除·OH作用的、以天然物質(zhì)為原料的產(chǎn)品。木瓜多糖具有很好的抗氧化、清除超氧自由基的作用。李南薇等[25]對皺皮木瓜葉多糖抗氧化活性進行研究，結(jié)果表明皺皮木瓜葉多糖具有較強清除DPPH·和·OH自由基的能力，其IC50分別為29和110 μg/mL。有報道從提取過綠原酸的木瓜濾渣中提取的多糖，對DPPH·和·OH自由基清除率分別達(dá)到28.78%和47.90%[20]。劉捷等[26]通過對木瓜多糖進行硫酸化的結(jié)構(gòu)修飾，對其抗氧化能力進行考察，結(jié)果表明，硫酸化多糖清除超氧自由基的作用比未修飾的顯著增強，從30%顯著提升到57%。大量研究結(jié)果表明，木瓜多糖對超氧自由基清除能力顯著，且隨著多糖濃度增大，清除能力逐漸增大。木瓜多糖為3 mg/mL時，清除率達(dá)到81%。結(jié)果說明皺皮木瓜多糖對超氧自由基的清除率與多糖用量存在量效關(guān)系。

2.2 護肝活性

肝臟是人體內(nèi)最大的實質(zhì)性腺體，是體內(nèi)新陳代謝的中心站。肝損傷是肝臟最常見的病例過程，由此引起的肝臟疾病如肝纖維化、肝硬化及肝腫瘤等嚴(yán)重危害人類健康。楊嬌嬌等[27]構(gòu)建CCl4所致小鼠急性肝損傷模型，探討皺皮木瓜多糖對CCl4所致小鼠急性肝損傷的保護作用；CCl4所致小鼠急性肝損傷，通過脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生過量自由基損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致試驗?zāi)Ｐ托∈笱宓腁LT顯著升高，肝臟DMA含量增高和SOD含量明顯降低。結(jié)果表明，皺皮木瓜多糖能降低血清中ALT，提高肝細(xì)胞中的SOD、GSH、GSH-PX含量，降低MDA和NO含量；其作用機制可能是木瓜多糖能清除自由基、抑制過氧化反應(yīng)、增加SOD活性、減少MDA生產(chǎn)、減少肝細(xì)胞破壞并促進其再生和修復(fù)。陳雪梅[28]構(gòu)建CCl4所致小鼠急性肝損傷模型，觀察皺皮木瓜多糖對大鼠肝損傷中血清酶、蛋白合成能力的影響，探討木瓜多糖多肝損傷的保護作用及可能機制。結(jié)果表明，皺皮木瓜多糖能改善CCl4所致肝損傷，其機制可能與其增加自由基清除酶活力、清除輻射過程中脂質(zhì)過氧化物的形成及降低TGF-β1mRNA的表達(dá)有關(guān)。

2.3 抗炎活性

李世剛等[29]建立小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）模型，檢測小鼠足爪的腫脹度，測定脾、胸腺、肝臟的指數(shù)，噻唑藍(lán)（MTT）法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-4（IL-4）的水平，研究皺皮木瓜多糖對小鼠AA病理改變及炎癥因子表達(dá)的影響。結(jié)果表明：木瓜多糖對佐劑性關(guān)節(jié)炎具有明顯的治療作用，其原因可能是木瓜多糖對AA小鼠過高的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有下調(diào)作用；另外，木瓜多糖可抑制TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，促進IL-4的表達(dá)，調(diào)節(jié)促炎和抗炎因子的表達(dá)，進而恢復(fù)細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)水平。薛丹[30]根據(jù)炎癥的不同時期表現(xiàn)，采用不同動物模型探討皺皮木瓜多糖的抗炎活性及機制。通過體外脂多糖LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NR8383產(chǎn)生的體外炎癥模型，皺皮木瓜多糖顯著降低細(xì)胞上清炎癥因子TNF-α、IL-1β和COX-2及細(xì)胞內(nèi)NO含量水平，且呈劑量依賴性。在試驗動物體內(nèi)醋酸致毛細(xì)管通透性模型、紅細(xì)胞凝聚試驗?zāi)Ｐ秃屯耆ナ阶魟┠Ｐ椭?，皺皮木瓜多糖有較好的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活性，其通過抑制免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。同時，皺皮木瓜各劑量組給藥后試驗動物體重未出現(xiàn)明顯降低，說明其在動物體內(nèi)毒性較低。

2.4 抗凝血活性

血小板活化與聚集是導(dǎo)致血栓形成的重要因素。楊之敏等[31]以家兔建立模型，分空白組、阿司匹林組、皺皮木瓜多糖組（17，34和68 g/L）。分別研究木瓜多糖對膠原、花生四烯酸（AA）、二磷酸腺苷（ADP）及凝血酶作用后血小板聚集的影響。通過監(jiān)測誘導(dǎo)后血小板中5-羥色胺含量、肝素凝血酶凝固時間及血小板釋放丙二醛含量的變化，進而探討木瓜多糖抗凝血機制。結(jié)果表明，皺皮木瓜多糖可以抑制由膠原、花生四烯酸（AA）、二磷酸腺苷（ADP）及凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，其作用機制抑制家兔血小板5-羥色胺釋放，減少血栓素A2生成，達(dá)到抗血小板聚集、抑制血小板釋放血小板因子Ⅳ起到抗血小板聚集的目的。研究說明木瓜多糖通過抑制血小板釋放活性物質(zhì)，具有明顯的抗凝血效果。

3 結(jié)語及展望

皺皮木瓜多糖在提取方法上以水提醇沉為主；微波、超聲和酶法等方法使其提取率提高，提取時間縮短，工藝簡單，成本低。傳統(tǒng)有機溶劑對皺皮木瓜多糖進行分離純化，同時許多新技術(shù)正運用于多糖的分離純化，如膜分離、大孔樹脂柱吸附、酶分離等。但提取分離、純化仍存在不足。同時多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而皺皮木瓜多糖的結(jié)構(gòu)未被完全表征，作用機制也還不明確，皺皮木瓜多糖的構(gòu)效關(guān)系和量效關(guān)系及其生物活性需進一步研究。

皺皮木瓜多糖具有抗衰老、抗凝血、抗炎、護肝、抗病毒等作用，還是理想的免疫增強劑。通過對木瓜多糖的深入研究，可高效精確地發(fā)揮木瓜多糖的作用，在藥用開發(fā)的同時，還可以用于保健、飲品、大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，皺皮木瓜多糖的研究，應(yīng)從優(yōu)化提取工藝、改進其分離純化方法出發(fā)，重點研究其結(jié)構(gòu)、生物活性及其應(yīng)用，在藥品、食品、保健品和化妝品多領(lǐng)域充分利用開發(fā)木瓜這一寶貴資源。皺皮木瓜多糖的研究對社會經(jīng)濟、生活健康和木瓜產(chǎn)業(yè)具有重要意義。