陳 浩，王道偉

吉林省公主嶺市葦子溝畜牧站，吉林公主嶺 136100

恩諾沙星是喹諾酮類抗菌藥，因其能抑制細(xì)菌DNA 螺旋酶，抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強(qiáng)，已成為獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一，被大量用于治療、預(yù)防和促進(jìn)生長。由于其耐藥性和潛在的致癌性，歐盟、日本及我國均制定了在組織中的最高殘留限量。本方法參照農(nóng)業(yè)部1025 號(hào)公告—25—2008 和試劑盒相關(guān)材料，通過規(guī)范各檢驗(yàn)步驟，達(dá)到了較好的分析結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀(ThermoFisher)、高速冷凍離心機(jī)(ThermoFisher)、氮吹儀、渦旋儀(1NA)、振蕩器(1NA)。

1.2 藥品試劑

試劑盒提供。

2 樣品處理

2.1 稱取均質(zhì)后的組織樣本于50 mL 離心管中，加入氫氧化鈉溶液，充分振蕩混勻10 min，5 000 轉(zhuǎn)離心10 min。

2.2 取4 mL 上清液至新的50 mL 離心管中，分別加入4 mLO.2M 磷酸鹽緩沖液和8 mL 二氯甲烷，振蕩10 min，5 000 轉(zhuǎn)離心10 min。

2.3 除去上層，取6 mL 下層有機(jī)相至l0 mL 干凈玻璃管中，55 ℃水浴氮?dú)獯蹈伞?/p>

2.4 加入l mL 復(fù)溶工作液，渦旋2 min 溶解干燥的殘留物，加入l mL 正己烷，渦旋2 min，5 000 轉(zhuǎn)離l0 min。

2.5 除去上層正己烷及中間層雜質(zhì)，取下層50 μL用于分析。

3 試劑盒操作

3.1 加入標(biāo)準(zhǔn)晶及樣品到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)二抗50 μL，再加入抗體工作液50 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板模蓋板后于25 ℃避光放應(yīng)60 min。

3.2 洗板：小心揭開蓋板模，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250 μL/孔，充分洗滌5 次，每次間隔10 s，甩掉孔內(nèi)液體，用吸水紙拍干。

3.3 顯色：加入底物液A 液50 μL/孔，再加入底物液B 液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板模蓋板后于25 ℃避光放應(yīng)30 min。

3.4 測定：加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于430/630 血處檢測，在添加回收結(jié)果5 min 內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。

4 數(shù)據(jù)結(jié)果

4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度：O、0.5 、1.5 、4.5 、13.5 、40.5 ng/mL。

4.2 添力口濃度：lO L、20 、30 ng/mL。

4.3 此方法的稀釋倍數(shù)：2。

4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性：以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)晶濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，經(jīng)軟件繪制曲線。相關(guān)系數(shù)R2=O.9945，線性良好。

5 討論

5.1 樣品前處理

5.1.1 稱樣要盡量準(zhǔn)確，當(dāng)樣品量不為3.00 g 時(shí)，計(jì)算添加濃度要算進(jìn)質(zhì)量數(shù)。

5.1.2 在空白肉中加入標(biāo)準(zhǔn)后，要渦旋后靜置5 min，令標(biāo)液滲入組織中。

5.1.3 離心要充分，本試驗(yàn)選擇提高轉(zhuǎn)速與時(shí)間來保證液體的充分分離。

5.1.4 離心管結(jié)實(shí)密封性好，由于離心后要加入二氯甲烷有機(jī)試劑，為防止振蕩時(shí)液體流出，應(yīng)選用高品質(zhì)的離心管。

5.1.5 要吸去上層水相后再吸取6 mL 下層有機(jī)相，不應(yīng)直接伸進(jìn)下層取液，否則會(huì)帶入部分水相影響吹干效果。

5.2 試劑盒操作

5.2.1 吸取標(biāo)準(zhǔn)及樣品時(shí)，移液槍可以選擇吸二打一(一檔進(jìn)一檔出)，也可以吸一打二(一檔進(jìn)二檔出)，但在吸液量小于等于20 μL 時(shí)應(yīng)選擇吸一打二，避免有氣泡。

5.2.2 吸液前槍頭要潤洗2 ～3 次，排除液體的表面張力，潤洗液要棄去。

5.2.3 吸液時(shí)槍頭要垂直于微孔，不要碰到孔壁，更不要碰到孔底部。吸液要準(zhǔn)確，盡量使兩孔平行。5.2.4 洗板時(shí)有氣泡可用干凈的槍頭戳破，只戳破氣泡即可，不要碰到孔的底部影響結(jié)果。每個(gè)氣泡要換新的槍頭。

5.2.5 甩干時(shí)可直接將板垂直倒過來停留一會(huì)再拍干，防止液體的交叉污染。

5.2.6 加完終止液后要在5 min 內(nèi)及時(shí)上機(jī)測定。

5.3 添加計(jì)算

一般添加濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度的范圍內(nèi)，最好在整個(gè)曲線的中部。所以選擇添加濃度是要先除以稀釋倍數(shù)后令其落在曲線中部即可，通過高標(biāo)濃度值及稱樣量等計(jì)算出添加體積數(shù)。

目前在實(shí)驗(yàn)室畜禽肉中恩諾沙星的檢出率還是有一定比例，可能與對(duì)養(yǎng)殖戶獸藥應(yīng)用知識(shí)的宣傳普及不到位有關(guān)，各種獸藥在動(dòng)物體內(nèi)的殘留時(shí)間不同。恩諾沙星的排泄主要通過腎臟，其次通過膽汁排出，雞體內(nèi)的恩諾沙星消除比較緩慢，其休藥期為12 d。