辛海云，孟繁明，胡斌，李寶紅，杜宗亮，2*，李劍豪*

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所/畜禽育種國家重點實驗室/廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室,廣東 廣州 510640；2. 清遠(yuǎn)市龍發(fā)種豬有限公司/廣東省種豬育種工程技術(shù)研究中心,廣東 英德 513057；3. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心,廣東 茂名 525000

現(xiàn)代化的養(yǎng)殖業(yè)以集約化和規(guī)?；癁樘攸c。發(fā)情鑒定在家畜的繁殖管理中具有重要作用，通過發(fā)情鑒定可以準(zhǔn)確及時的判斷家畜的發(fā)情狀態(tài)，確定最佳配種時間，保證家畜有較高的受胎率、產(chǎn)仔數(shù)和繁殖性能，并及時淘汰繁殖性能低下家畜，提高經(jīng)濟(jì)效益。目前生產(chǎn)上常用的發(fā)情鑒定方法包括觀察法、試情法、激素法等，以及結(jié)合發(fā)情鑒定輔助監(jiān)測設(shè)備等數(shù)字化鑒定系統(tǒng)[1-2]。這些方法各有利弊，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性參差不齊，尋求靈敏、高效且對牲畜無創(chuàng)的新型發(fā)情鑒定方法仍是一項對生豬生產(chǎn)具有科學(xué)指導(dǎo)意義且市場應(yīng)用前景廣闊的前沿課題。

發(fā)情鑒定新型方法的探索在各種家畜中都在不斷進(jìn)行。蛋白、類固醇、電解質(zhì)素等許多生物分子合成都會受到動物發(fā)情的調(diào)控，且在卵泡生長發(fā)育調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。血液[3]、尿液[4]、唾液[5]、子宮頸陰道黏液[6]等各種體液中生物分子表達(dá)差異成為母畜發(fā)情診斷的重要靶標(biāo)。

唾液中的成分包括唾液腺(頜下腺、舌下腺、腮下腺)的分泌物，牙齦液和口腔微生物區(qū)系[7]。其分泌物包括了緩沖液，鹽，核酸，有機(jī)物和蛋白[8-9]。唾液的存在有利于多種生物學(xué)功能，如潤滑口腔，有助于咀嚼和吞咽，保護(hù)口腔組織和牙齒，唾液中的蛋白酶使口腔成為最早起始消化的器官。唾液的成分和性質(zhì)會因各種動物的飲食偏好不同而變化[10-11]。

唾液相對于尿液和血液等體液，具有采集方便、分析樣品量充足、成本低、穩(wěn)定性強(qiáng)、無創(chuàng)且對動物應(yīng)激小等特點，在家畜生理健康、疾病監(jiān)控和早期診斷方面具有重要的生物學(xué)意義。近年來，通過生物鏡檢、PCR、色譜-質(zhì)譜分析、氣相色譜-質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析等先進(jìn)技術(shù)手段，從發(fā)情周期不同時間點家畜唾液中篩選特異性發(fā)情標(biāo)志物作為分子靶標(biāo)，在新型高效家畜發(fā)情診斷技術(shù)的研究方面逐漸增多。本文將從唾液晶體形態(tài)、反轉(zhuǎn)錄、蛋白組成等方面分析唾液在發(fā)情鑒定中的應(yīng)用，為服務(wù)我國的畜牧生產(chǎn)實踐提供理論和技術(shù)支持。

1 利用唾液的晶體結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行發(fā)情鑒定

唾液羊齒狀結(jié)晶就是發(fā)情期母畜唾液在載玻片上涂布干燥后形成的羊齒狀結(jié)晶。羊齒狀結(jié)晶模式在唾液、宮頸黏液、眼淚和鼻黏液都能觀察到。相比其他體液，唾液在任何時期都容易獲得，且唾液腺是雌激素的一個目標(biāo)組織[12]。體液晶體形態(tài)的周期性改變與雌激素和孕激素的分泌密不可分[13]；雌激素有助于結(jié)晶形成，而P4抑制這一結(jié)晶。唾液羊齒狀結(jié)晶主要是排卵前由于高濃度的鹽和黏膜對于高水平雌激素的響應(yīng)而引起。這些結(jié)晶體是NaCl[14]。其形成是由于黏蛋白(mucine)的存在，其他電解質(zhì)類、蛋白和碳水化合物也是結(jié)晶形成過程中必不可少的物質(zhì)。

陰道或子宮頸黏液結(jié)晶體檢測法最早是在女性上應(yīng)用報道[15]。許多市面上銷售的女性用排卵檢測試劑盒就是基于排卵階段女性唾液中形成羊齒狀結(jié)晶而進(jìn)行判斷，使得女性自行檢測排卵期更加簡便和廉價。類似的檢測在畜牧業(yè)中應(yīng)用較少。以水牛為例，其子宮頸陰道黏液在安靜發(fā)情狀態(tài)下缺乏明顯的黏液分泌，RAVINDER等[16]系統(tǒng)研究了水牛發(fā)情周期的唾液晶體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)發(fā)情期其羊齒狀晶體形態(tài)明顯，在其他時期則表現(xiàn)不同的結(jié)晶形態(tài)，基于唾液羊齒狀晶體形態(tài)進(jìn)行發(fā)情鑒定的準(zhǔn)確性可高達(dá)80%，極顯著高于野外狀態(tài)下判定的準(zhǔn)確性(50%)，因而可以與其他方法結(jié)合進(jìn)行綜合評定。通過觀察唾液晶體形態(tài)還可以實現(xiàn)在對牛、駱駝、狗等許多動物的妊娠診斷和配種[17-18]。

相對于超聲波法、激素法、組化法等檢測方法，唾液結(jié)晶法不需要太復(fù)雜的實驗室條件和設(shè)備，樣品隨時可以獲取，人員經(jīng)費消耗少，可以簡單快速鑒定發(fā)情，是適合小規(guī)模養(yǎng)殖場使用的理想方法。其準(zhǔn)確性在不同研究中結(jié)果不同，需要結(jié)合畜牧場實際進(jìn)行合理評估，或者通過與其他判定方法結(jié)合使用，提高鑒定準(zhǔn)確率。

2 利用唾液的蛋白組學(xué)差異進(jìn)行發(fā)情鑒定

唾液的成分隨生理狀態(tài)和環(huán)境的不同而波動較大，唾液蛋白表達(dá)譜在不同生理病理狀態(tài)下存在較大差異，因而可以用于疾病的檢測。蛋白具有穩(wěn)定性強(qiáng)、獲取方便、對動物無創(chuàng)等特點，因而蛋白標(biāo)記物在許多不同目的的診斷中都有涉及[7]。相關(guān)文獻(xiàn)在口腔疾病方面報道尤其較多，但在發(fā)情周期內(nèi)表達(dá)差異方面的報道在近幾年才逐漸興起。

利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析母畜發(fā)情周期不同階段唾液蛋白質(zhì)表達(dá)差異，以尋找標(biāo)記蛋白，其分析技術(shù)手段包括基于2D凝膠電泳聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)和四級飛行時間質(zhì)譜，以及LC聯(lián)合電噴射離子化飛行時間質(zhì)譜(ESI)-TOF MS進(jìn)行個體本身或者不同個體間的全唾液成分差異分析[7]。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行venn diagram分析，尋找發(fā)情期特異表達(dá)蛋白，并通過Western Blot等方法進(jìn)行驗證。利用GO分析及功能注釋、細(xì)胞通路分析等生物信息學(xué)分析方法繪制功能圖譜，并對相關(guān)調(diào)控通路注解，探索特異表達(dá)蛋白在發(fā)情中的功能，以尋找特異蛋白標(biāo)記物進(jìn)行發(fā)情鑒定

基于以上研究思路，MUTHUKUMAR[7]等采用凝膠電泳結(jié)合LC-MS/MS建立了水牛整個發(fā)情周期的全唾液蛋白表達(dá)譜。SDS-Page共分離得到12個蛋白條帶，分子量范圍為14.5-120 kDa，這與其他報道中牛的唾液蛋白條帶數(shù)相同[19-20]。質(zhì)譜結(jié)果顯示整個發(fā)情周期共有179種蛋白，其中37種蛋白是發(fā)情期特異表達(dá)。經(jīng)過免疫印跡驗證，β-烯醇酶和TLR-4在發(fā)情期確實特異表達(dá)。功能注釋顯示它們在發(fā)情期主要發(fā)揮結(jié)合蛋白的功能。利用同樣的研究方法，該團(tuán)隊在子宮頸黏液發(fā)現(xiàn)68種發(fā)情期特異性表達(dá)蛋白。相似的研究在SHASHIKUMAR[21]的團(tuán)隊研究中也有報道，該團(tuán)隊共篩選得到62種發(fā)情期特異表達(dá)蛋白。兩個團(tuán)隊在水牛唾液中尋找到的差異表達(dá)蛋白種類有其共同點，但大部分蛋白種類存在較大差異，這可能是由于兩者發(fā)情階段劃分以及質(zhì)譜分析方法的不同導(dǎo)致。

利用蛋白組學(xué)研究母畜發(fā)情周期唾液蛋白種類的方法可以為研究篩選和鑒定母畜唾液發(fā)情期特異表達(dá)蛋白提供新的研究思路和方法手段。然而，大部分研究中發(fā)情期特異表達(dá)蛋白的后續(xù)驗證不足，并且如何將這些差異蛋白利用到發(fā)情鑒定中仍需進(jìn)行深入研究。

3 利用唾液的揮發(fā)物差異進(jìn)行發(fā)情鑒定

唾液中包含多種揮發(fā)性化合物，這些揮發(fā)性化合物按照一定的比例相互作用才能發(fā)揮化學(xué)信號的作用[22]。經(jīng)過乙醚等有機(jī)溶劑萃取后經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析(GC-MS)，可篩選得到發(fā)情期特異性的化學(xué)信號。

SANKAR等[23]利用這種方法在母牛唾液中篩選得到三甲胺，乙酸，苯酚，戊酸和丙酸等發(fā)情期特異性的化合物，后續(xù)的行為分析發(fā)現(xiàn)三甲胺可以吸引雄性動物，因而可以作為一種潛在的發(fā)情期特異性的唾液化學(xué)信號。類似的方法，KARTHIKEYAN等[22]使用氣相色譜分析水牛繁殖周期中的唾液成分，共發(fā)現(xiàn)11種化合物。其中，P-cresol(對甲酚)是3種發(fā)情期特異性化合物之一。比較P-cresol與兩種氣味結(jié)合蛋白(OBP)和Beta-乳球蛋白之間的作用模式，發(fā)現(xiàn)OBP穩(wěn)定性強(qiáng)，與P-cresol具有很強(qiáng)的親和力，氫鍵相互作用分析顯示OBP在唾液中負(fù)責(zé)信息素(pheromone)的釋放。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示牛類的OBP屬于獨立的分支。其中P-cresol是一種異性吸引劑，相對其他類型的甲酚，其誘導(dǎo)公馬的勃起水平最高。因此P-cresol可以作為水牛潛在的生殖狀態(tài)標(biāo)記物。而P-cresol在糞便中也存在，而且可以調(diào)節(jié)動物行為。在母馬中，P-cresol是一種有效的揮發(fā)性排卵化學(xué)標(biāo)記物，它是哺乳動物的尿液中一種天然存在的化合物。

基于唾液中揮發(fā)性化學(xué)成分的存在，結(jié)合犬類動物靈敏的嗅覺，可以對其進(jìn)行訓(xùn)練，以識別發(fā)情時母畜牛奶、尿液、血液等體液中揮發(fā)性物質(zhì)所散發(fā)的氣味，成為發(fā)情探測犬，短時間集中訓(xùn)練即可達(dá)到較高的準(zhǔn)確率(>80%)。相對其他體液，利用探測犬對奶牛發(fā)情周期唾液氣味檢查的準(zhǔn)確率表現(xiàn)稍差，范圍在40%～75%[24]，這可能是由于唾液中揮發(fā)性物質(zhì)的濃度較低，而探測犬的訓(xùn)練強(qiáng)度不足。

這種發(fā)情相關(guān)的揮發(fā)性成分的發(fā)現(xiàn)為發(fā)情檢測新技術(shù)帶來了一線希望，使簡單、無創(chuàng)的場地發(fā)情檢測方法成為可能[22]，但利用唾液揮發(fā)物進(jìn)行發(fā)情監(jiān)測的方法技術(shù)仍需完善，其準(zhǔn)確率也有待提高。

4 利用唾液中胞外RNA的差異進(jìn)行發(fā)情鑒定

在多種生物標(biāo)記物中，胞外RNA的重要性正在逐漸顯現(xiàn)[25]。唾液中胞外RNA在人類臨床診斷，尤其是人類癌癥的診斷方面應(yīng)用較廣[26]。研究表明用未經(jīng)RNA分離的原始唾液進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析可用于臨床診斷分析[27]。然而這項診斷應(yīng)用方法在各類牲畜生理狀態(tài)檢測方面仍然不能得到有效應(yīng)用，相關(guān)報道也很少。ONTERU等[25]探索了應(yīng)用水牛唾液進(jìn)行直接轉(zhuǎn)錄方法尋找發(fā)情期唾液RNA標(biāo)記物的可行性。將水牛唾液去掉細(xì)胞和懸浮物質(zhì)后不經(jīng)RNA提取，直接用于RT-PCR獲得發(fā)情標(biāo)記蛋白目的基因片段后進(jìn)行實時定量分析，隨后采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗，顯示HSP70和TLR4在發(fā)情期的表達(dá)量顯著高于間情期。因此直接應(yīng)用未經(jīng)RNA分離的原始唾液進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄分析可以作為一種簡便鑒定反芻動物發(fā)情期唾液RNA標(biāo)記物的方法。

在應(yīng)用唾液進(jìn)行直接反轉(zhuǎn)錄PCR前，引物設(shè)計需要注意在mRNA序列外顯子-外顯子的邊界處，以防擴(kuò)增到唾液中的DNA。這種方法需要大規(guī)模的生物組學(xué)分析為前提，以提供可能的發(fā)情期唾液新型RNA標(biāo)記物，且該技術(shù)在其他哺乳動物上的應(yīng)用是否可行仍需進(jìn)一步探索。

5 利用唾液中的電解質(zhì)平衡差異進(jìn)行發(fā)情鑒定

發(fā)情周期中激素濃度不斷變化，由此而引發(fā)的體液中相關(guān)物質(zhì)物理特性和生物化學(xué)組成的周期性改變可以被用來判定發(fā)情周期的不同階段。在排卵期，唾液中的許多電解質(zhì)如Na、K、Mg、Cl、無機(jī)P的濃度會出現(xiàn)波動。這些生理學(xué)的改變主要是由于卵巢激素濃度變化而引起，如雌激素和孕酮的濃度隨發(fā)情周期進(jìn)程而改變。

卵巢激素對水平衡和電解質(zhì)平衡的影響及其相關(guān)性研究在文獻(xiàn)中已經(jīng)有所報道[28]。雌激素導(dǎo)致腸道中Ca的攝入顯著上升，而Ca排出明顯受抑制[29]。此外，女性唾液羊齒狀晶體形成跟排卵期一致，這是由于受雌性激素的影響唾液中的NaCl周期性的增加[14]。孕酮有促進(jìn)尿鈉排泄的效果，而且排卵后孕酮濃度的升高會引起醛固酮濃度的補(bǔ)償上升和隨后Na,K,Ca等一系列電解質(zhì)濃度的改變。Mg具有調(diào)節(jié)月經(jīng)周期的功能，而且基礎(chǔ)代謝會發(fā)生改變。

DEVI等[30]測定了Murrah 水牛發(fā)情周期不同階段唾液中無機(jī)物(包括鈣、無機(jī)磷、鎂、鈉、鉀、氯)濃度比例的變化情況，發(fā)現(xiàn)這些礦物元素的濃度在發(fā)情階段比其他階段顯著提高。所有礦物質(zhì)元素的濃度與血漿中雌激素的濃度呈顯著正相關(guān)，而Ca, Mg, Na、Cl的濃度跟血漿中孕酮的濃度呈顯著負(fù)相關(guān)。這與JOHNSON等[31]對于發(fā)情期階段狗中的電解質(zhì)平衡相關(guān)的研究結(jié)果類似。這些結(jié)果說明唾液中的礦物質(zhì)濃度和電解質(zhì)濃度在發(fā)情周期的不同階段是變化的，這些結(jié)果可以用來輔助發(fā)情鑒定。

利用唾液理化性質(zhì)和電解質(zhì)組成變化特點輔助發(fā)情，其相關(guān)研究仍需增加動物樣本量來驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，研究發(fā)情期唾液電解質(zhì)模式的改變或許為利用無創(chuàng)生物學(xué)體液來理解乳制品生產(chǎn)動物其普遍存在的礦物質(zhì)缺乏癥狀等繁殖障礙疾病與機(jī)體多種繁殖激素之間的相關(guān)性研究提供新思路。

6 結(jié)論

綜上，唾液作為一種獲取簡便的體液，在發(fā)情鑒定中具有多重優(yōu)勢，是進(jìn)行無創(chuàng)生物標(biāo)記物篩選的理想工具和提高牲畜發(fā)情鑒定效率和準(zhǔn)確性的優(yōu)良媒介，因而其在動物發(fā)情鑒定中應(yīng)用前景廣泛。然而目前應(yīng)用唾液進(jìn)行發(fā)情鑒定的方法多數(shù)集中在實驗室研究階段，篩選到的生物標(biāo)記物需要大量的生物樣本量來進(jìn)行驗證，相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)也需同步進(jìn)行，使唾液發(fā)情鑒定方法更加普及。生產(chǎn)中需根據(jù)養(yǎng)殖場實際情況合理選擇一種或多種方法，將唾液檢測方法和其他方法有機(jī)結(jié)合，提高發(fā)情鑒定準(zhǔn)確率，使牲畜繁殖性能得到充分發(fā)揮，提高生產(chǎn)效益。