田萬年，宋旗，孫凰員，鄭秀紅

(1. 吉林農業(yè)科技學院動物科技學院，吉林 吉林 132101；2. 吉林省龍井市德新鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，吉林 龍井 133400)

羊泰勒蟲病是由泰勒蟲寄生于羊紅細胞或網狀內皮細胞內引起的經蜱傳播血液原蟲病[1]。本病以體表淋巴結腫大、貧血、血紅蛋白尿為主要特征，對羔羊和外地引進羊危害嚴重[2]。羊泰勒蟲病的診斷一般為血涂片染色后，通過顯微鏡觀察紅細胞內蟲體確診，近年來隨著分子生物技術的迅速發(fā)展，相繼建立了檢測羊泰勒蟲PCR和熒光定量PCR方法[3-4]。傳統(tǒng)病原學血液涂片鏡檢受人為因素影響較大，容易出現漏檢和誤診，PCR技術具有特異性強、靈敏度高的特點，已廣泛應用于羊泰勒蟲病的診斷和流行病學分析[5-6]。泰勒蟲主要表面蛋白(major piroplasm surface protein, MPSP)是泰勒蟲感染紅細胞階段蟲體分泌的一種膜內蛋白，是泰勒蟲所特有的膜表面蛋白, 其編碼的基因在遺傳分類和分子診斷方面具有較好應用價值[7-8]。目前，國內尚未見套式PCR檢測方法應用于羊泰勒蟲病診斷的研究報道。本試驗利用羊泰勒蟲MPSP基因的特異性，建立了羊泰蟲套式PCR檢測方法，為基層獸醫(yī)工作人員對該病的診斷提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

30份綿羊抗凝血于2017年5月采自吉林省琿春地區(qū)，同時用載玻片制作血涂片供染色鏡檢。

1.2 血液涂片染色

制成的血液涂片滴加甲醇固定，放入裝有吉姆薩染液的染缸中，室溫染色6 h，然后取出血液涂片用蒸餾水沖洗，自然晾干后顯微鏡鏡檢。

1.3 基因組DNA的提取

臨床樣本綿羊血液DNA提取按照天根生化科技有限公司血液DNA提取試劑盒說明書進行操作。羊巴貝斯蟲(Babesia)、羊無漿體(Anaplasmaovis)、弓形蟲(Toxoplasmagondii)基因組DNA由日本帶廣畜產大學玄學南教授惠贈。

1.4 引物設計與合成

根據GenBank 收錄的梨形蟲MPSP序列(GQ281044)，利用引物設計軟件設計兩對特異性引物(見表1)。

表1 MPSP基因引物序列

引物名稱引物序列(5'-3')產物長度/bp退火溫度/℃MPSP外引物P1: ATGTTGTCCAAGAGATCATTCP2: CTAGAAATAGTAGGATACTGCG85255MPSP內引物N1: GAAGAAGAGCGACAAGGAATGN2: GATACTGCGAGTAAGGCGATG49258

1.5 PCR擴增

先用外引物P1和P2進行第一輪PCR擴增，取擴增出的產物1 μL為模板，再用內引物N1和N2進行第二輪PCR擴增。反應程序：預變性溫度為95 ℃ 5 min，變性溫度為94℃ 45 s，退火溫度為53 ℃ ～60 ℃ 40 s，延伸溫度為72 ℃ 1 min，循環(huán)數為30個；最后延伸溫度為72 ℃ 5 min。

1.6 目的基因序列測定

第一輪陽性PCR產物回收純化，與克隆載體T載體連接、轉化，經鑒定為陽性的質粒送大連寶生物工程技術公司進行測序。

1.7 特異性試驗

應用所建立的套式PCR方法分別檢測無漿體、羊巴貝斯蟲、羊泰勒蟲與弓形蟲的DNA，以評價該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗

將帶有MPSP基因的質粒用分光光度計測量濃度后，對其進行10倍倍比稀釋，濃度為106～100拷貝數，分別進行套式PCR和普通PCR擴增，對比最低檢測濃度進行對比。

1.9 臨床樣本檢測

對30份綿羊血液進行套式PCR檢測，同時應用田萬年等[9]報道的普通PCR檢測方法、血液涂片法平行檢測，并比較檢測結果，評價羊泰勒蟲感染情況。

2 結果

2.1 血涂片鏡檢

綿羊血涂片染色后，在顯微鏡下發(fā)現梨籽形和點狀羊泰勒蟲蟲體，見圖1。

圖1 血液涂片吉姆薩染色鏡檢結果(1 000×)

2.2 PCR擴增

DNA經外引物PCR擴出約為852 bp目的條帶，退火溫度為55 ℃；經內引物PCR擴出約為492 bp目的條帶，最佳退火溫度為58 ℃(見圖2)。

M. DL 2000 DNA Marker；1. 第1輪PCR 產物；2，4.空白對照；3.第2輪PCR擴增產物

圖2 套式PCR擴增結果

2.3 目的基因序列測定

經序列測定顯示，所測得的羊泰勒蟲MPSP基因與NCBI網站收錄的羊呂氏泰勒蟲(GQ281044)核苷酸同源性為100%。

2.4 特異性試驗

該方法可特異性檢測出羊泰勒蟲基因組DNA，而以羊巴貝斯蟲、弓形蟲和綿羊無漿體的DNA為模板時未能擴增出相應基因片斷(圖3)，具有較好的特異性。

M. DL 2000 DNA Marker；1.羊泰勒蟲；2.羊巴貝斯蟲；3.弓形蟲；4.無漿體

圖3 特異性PCR擴增

2.5 敏感性試驗

應用所建立的套式PCR和普通PCR同時檢測被稀釋的質粒DNA，普通PCR檢測質粒DNA的最低濃度為103copies/μL(見圖4)；套式PCR檢測質粒DNA最低濃度為1 copies/μL(見圖5)。

M. DL 2000 DNA Marker；1～7. 106～100copies/μL；8. 空白對照

圖4 普通PCR敏感性

M. DL 2000 DNA Marker；1～7. 106～100copies/μL；8. 空白對照

圖5 套式PCR敏感性

2.6 臨床樣本檢測

通過對30份綿羊血液樣本的羊泰勒蟲檢測結果(見表2)顯示，套式PCR檢測陽性樣本14份，高于普通PCR(12份)和血液涂片染色(7份)，三者間陽性符合率為100%。

表2 臨床樣本檢測結果

方法被檢數陽性數陰性數陽性率/%套式PCR30141646.67普通PCR30121840.00血液涂片3072223.33

3 討論

我國最早發(fā)現羊泰勒蟲是在1958年，目前已在多個省份都有該病的流行報道，給養(yǎng)羊業(yè)造成較大的損失[9]。羊感染一定數量泰勒蟲才會表現出臨床癥狀，多表現為隱性感染。羊感染該蟲主要表現為免疫器官受損，引發(fā)免疫抑制，免疫功能下降，嚴重影響生產性能。對羊泰勒蟲病原的收集與鑒定是防治該病的基礎，羊泰勒蟲病的診斷多采用血液涂片鏡檢方法，該方法需要檢查人員掌握各種寄生蟲形態(tài)學方面的知識，因此不適用基層獸醫(yī)人員對該病的臨床診斷。

目前，國內針對羊泰勒蟲建立了多種分子生物學檢測方法。盛明宏等[3]建立了以18S rRNA為目的基因的PCR檢測方法，敏感性能達到0.12fg DNA；田萬年等[4]建立了以18S rRNA為目的基因的羊泰勒蟲熒光定量PCR方法，最低可檢測2.08×101copies/μL，比普通PCR敏感100倍。為提高套式PCR的特異性和敏感性，本研究所選的目的基因為泰勒蟲特有MPSP基因，該方法最低檢測限量為1拷貝數，是普通PCR的1 000倍，具有較好的特異性。應用本試驗建立的套式PCR方法通過對30份臨床血液樣本檢測，陽性率為46.6%(14/30)，高于普通PCR(40.00%，12/30)和血液涂片染色(23.33%，7/30)，三者間陽性符合率為100%。綜上，本研究所建立的套式PCR方法具有較好的敏感性、特異性和準確性，為獸醫(yī)人員對羊泰勒蟲病的診斷和流行病學調查提供了有效手段。