宋利娜，劉沂霖，任 銳，蘇 雙，尹榮蘭*

1.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，吉林長春 130062；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長春 130062

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種仔豬急性水樣腹瀉、嘔吐、脫水導(dǎo)致電解質(zhì)失衡而死亡的一種疾病。1978年比利時根特大學(xué)科學(xué)家根據(jù)科赫原則首次證明冠狀病毒為豬病毒腹瀉的病原。1982年P(guān)EDV首次在亞洲報道，2012年，PEDV再次席卷中國，與歐洲豬場病癥相比，亞洲豬場仔豬致死率更高，且流行較廣。2013年美國首次報道該病發(fā)生，一年內(nèi)造成800萬頭仔豬病死，并迅速傳至加拿大和墨西哥，隨后PEDV在亞洲其他國家爆發(fā)，如韓國、日本。

1 PEDV結(jié)構(gòu)

PEDV為直徑95～190 nm的冠狀病毒屬α冠狀病毒科病毒，PEDV基因組約為28 kb的單股正鏈RNA，包括5’帽子和3’poly尾巴，5’UTR和3’UTR及7個開放閱讀框，包括四個結(jié)構(gòu)蛋白（纖突蛋白S、囊膜蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N），其中S蛋白與宿主靶細(xì)胞受體結(jié)合介導(dǎo)病毒入侵和誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。

病毒與細(xì)胞受體的相互作用作為病毒生命周期的第一步，也是至關(guān)重要的一步，病毒與受體結(jié)合使病毒進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制增殖。冠狀病毒科包含多種重要的病毒，感染譜較廣，感染人類和動物，引起呼吸道和腸胃疾病。冠狀病毒有多種細(xì)胞受體已被鑒定，包括癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子1、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2和氨基肽酶N(APN)。例如，α冠狀病毒屬人類冠狀病毒NL63使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2作為其進(jìn)入細(xì)胞的受體。ACE2受體較早被鑒定為β冠狀病毒屬急性呼吸綜合征冠狀病毒的功能性受體。鼠肝炎病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒通過與癌胚抗原細(xì)胞粘附分子和雙肽酶4結(jié)合介導(dǎo)病毒感染。一些冠狀病毒，包括人類冠狀病毒OC43和牛冠狀病毒使用乙?；僖核嶙鳛槭荏w介導(dǎo)病毒入侵感染。

2 氨基肽酶N (APN)

氨基肽酶N作α冠狀病毒的主要受體，如豬傳染性胃腸炎病毒，人類α冠狀病毒229E，貓傳染性腹膜炎病毒和犬冠狀病毒利用氨肽酶N作為受體。PEDV利用APN作為一種細(xì)胞受體介導(dǎo)病毒入侵感染。受體結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞是病毒感染宿主細(xì)胞的必要步驟，導(dǎo)致病毒內(nèi)化，促進(jìn)病毒增殖復(fù)制。PEDV的宿主特異性、組織嗜性是由病毒的S蛋白與受體相互作用決定的。受體相互作用在冠狀病毒的細(xì)胞和組織嗜性以及發(fā)病機制和跨物種傳播中起著至關(guān)重要的作用。

2.1 氨基肽酶N的結(jié)構(gòu)

氨基肽酶N是一種II型鋅金屬蛋白酶，APN糖蛋白主要表達(dá)在腎臟、小腸、呼吸道上皮細(xì)胞上，可以被胰蛋白酶裂解成N端(95 kDa)和C端(50 kDa)兩個蛋白，APN是一種鋅依賴的蛋白酶，通過HELAH基序介導(dǎo)活性肽的N端氨基酸的分裂，以發(fā)揮酶的活性。APN還發(fā)揮著受體和信號分子的作用。PEDV感染細(xì)胞中，金屬蛋白酶ADAM17通過改變氨基肽酶N調(diào)節(jié)豬流行性腹瀉病毒感染。APN有7個結(jié)構(gòu)域，第一個結(jié)構(gòu)域在N端(aa17)上形成一個短的細(xì)胞質(zhì)尾部，結(jié)構(gòu)IV從71～252 aa，肽酶活性由域V和域VI(253～558 aa)所包含。VII域位于C端的由 581～967 aa組成的。

2.2 APN與PEDV感染

APN介導(dǎo)多種生命過程，包括抗原呈遞、細(xì)胞分化、細(xì)胞運動和冠狀病毒進(jìn)入。豬APN在腸道刷狀緣膜上大量表達(dá)。此外，它還表達(dá)在腎臟和呼吸道的上皮細(xì)胞表面。pAPN最初被確定為豬傳染性胃腸炎病毒的主要受體。在豬體內(nèi)，體外轉(zhuǎn)染和表達(dá)pAPN可以使MDCK細(xì)胞株感染PEDV，說明pAPN可能也是PEDV的受體。此外，將pAPN使用CRISPRCas9技術(shù)將其轉(zhuǎn)入至小鼠體內(nèi)，小鼠對PEDV具有易感性。MDCK細(xì)胞外源表達(dá)hAPN或pAPN使其具有易感性，提示PEDV-APN相互作用不具有物種特異性。此外，PEDV可以感染人、猴、豬、蝙蝠等多種細(xì)胞系。Vero細(xì)胞常被用于PEDV毒株的分離和繁殖，然而，Vero細(xì)胞蛋白組質(zhì)譜分析并無APN表達(dá)，細(xì)胞中缺乏mRNA轉(zhuǎn)錄本，這表明其他受體可能參與了PEDV進(jìn)入細(xì)胞。有學(xué)者質(zhì)疑pAPN作為功能受體的作用。最新研究表明，APN不是PEDV進(jìn)入病毒所必須的受體。到目前為止，尚缺乏直接證據(jù)表明在體外pAPN與PEDV S蛋白相互作用。雖然背后的機制尚未被破譯，但人們很容易推測，pAPN的表達(dá)水平可能與PEDV感染有關(guān)。

2.3 APN與冠狀病毒感染

冠狀病毒利用多種細(xì)胞蛋白作為細(xì)胞進(jìn)入的功能受體，例如錨定在S蛋白介導(dǎo)冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞。S蛋白裂解成受體結(jié)合S1亞基和膜融合S2亞基組成。S1亞基中的兩個區(qū)域，稱為S1-NTD和S1-CTD，在一些冠狀病毒中可能作為受體結(jié)合區(qū)域，APN結(jié)合域最近被證明位于PEDV S1的c端半?yún)^(qū)域(aa477～629)，對應(yīng)于TGEV S1的RBD(aa505～655)。有趣的是，盡管被認(rèn)為共享同一受體，但在已知對APN結(jié)合起關(guān)鍵作用的TGEV RBD延伸環(huán)內(nèi)的兩個芳香殘基在PEDV RBD中并未保守，這表明受體相互作用的模式不同。

2.4 APN與跨種傳播

與TGEV不同，PEDV與hAPN相互作用并利用hAPN作為受體。此外，PEDV還可以在體外感染除豬外的不同物種的多個細(xì)胞系，包括蝙蝠和靈長類動物(人類和非人類)。PEDV的基因組序列和基因組與蝙蝠α-冠狀病毒的關(guān)系要大于與同一屬的其他病毒的關(guān)系，這表明蝙蝠和豬之間可能已經(jīng)發(fā)生了跨種傳播，可能是通過其他的中間宿主。

3 PEDV 與其他受體

除了與APN相互作用外，PEDV還能與唾液酸結(jié)合。α-冠狀病毒、β冠狀病毒、γ冠狀病毒都可以結(jié)合唾液酸。研究表明，PEDV的唾液酸結(jié)合位點被證明發(fā)生在S蛋白的N端區(qū)域(aa1～320)，這一發(fā)現(xiàn)與其他冠狀病毒唾液酸結(jié)合位點一致。然而，目前尚不清楚S蛋白結(jié)合唾液酸是否能促進(jìn)PEDV進(jìn)入細(xì)胞。APN招募TGEV S1能通過其N端區(qū)(aa21～244)與唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸，Neu5Ac)和N-糖基神經(jīng)氨酸結(jié)合。唾液酸結(jié)合活性在細(xì)胞培養(yǎng)中對TGEV在較短的接種條件下會增強感染。使用家兔紅細(xì)胞證實PEDV具有血凝(HA)活性，但這種HA活性僅在用胰蛋白酶或神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理病毒后才能觀察到。研究證明PEDV S1可以與牛和豬的黏液結(jié)合。此外，N-乙酰神經(jīng)氨酸/唾液酸對PEDV S1表現(xiàn)出最高的結(jié)合親和力。還有研究表明硫酸肝素作為S蛋白的結(jié)合位點協(xié)助病毒進(jìn)入。其是否可作為功能受體介導(dǎo)病毒進(jìn)入有待確定。

4 總結(jié)

受體相互作用在冠狀病毒的細(xì)胞和組織嗜性以及發(fā)病機制和跨物種傳播中起著至關(guān)重要的作用。APN作為α-冠狀病毒的受體，其作用機制仍然不清楚，現(xiàn)有研究已證明其不是PEDV感染Vero和小腸上皮細(xì)胞所必須的功能受體?？赡艽嬖谥渌墓δ苁荏w，研究表明，整合素蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白均在PEDV感染過程中明顯增加，是否可以作為PEDV的功能受體有待研究證實，所以了解APN的結(jié)構(gòu)功能為PEDV的功能受體鑒定及疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：略