方焱秋,汪雪燁,顧達(dá)夫

長(zhǎng)春新牧科技有限公司,吉林長(zhǎng)春 130000

肉種牛胚胎技術(shù)的應(yīng)用，可充分發(fā)揮優(yōu)質(zhì)種母牛的繁殖能力，擴(kuò)大了良種畜群，縮短了優(yōu)質(zhì)種牛的育種時(shí)間，保存了優(yōu)良種源，具有重大的實(shí)用價(jià)值，是現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的重要領(lǐng)域之一。

本項(xiàng)目在長(zhǎng)春新牧科技有限公司進(jìn)行，我公司是目前國(guó)內(nèi)較大的核心肉種牛繁育場(chǎng)，具有國(guó)內(nèi)一流的基礎(chǔ)設(shè)施設(shè)備，肉用種牛及技術(shù)隊(duì)伍，公司有加拿大引進(jìn)的優(yōu)良的肉用種母牛214頭，用于該項(xiàng)目的供體牛就從這些牛的純繁后代中優(yōu)選，有3個(gè)品種，即西門塔爾牛、夏洛來(lái)牛、利木贊牛，主要設(shè)備從德國(guó)引進(jìn)，已具有獨(dú)立開(kāi)展這項(xiàng)工作的能力。

1 胚胎生產(chǎn)的工藝流程

1.1 對(duì)供體牛（良種個(gè)體）和受體牛（一般個(gè)體）用促性腺激素進(jìn)行同期發(fā)情處理。

1.2 用促性腺激素對(duì)供體牛做超數(shù)排卵處理。

1.3 超數(shù)排卵的母牛在發(fā)情后，選擇同種優(yōu)秀的公牛進(jìn)行配種或人工受精。

1.4 胚胎收集，把早期胚胎從供體母牛的子宮內(nèi)沖洗出來(lái)（又稱沖卵）。

1.5 沖卵后，對(duì)胚胎進(jìn)行質(zhì)量檢查，這時(shí)的胚胎應(yīng)發(fā)育到桑椹胚或囊胚階段。

1.6 將收集的胚胎直接向受體進(jìn)行胚胎移植或胚胎冷凍，然后保存在-196℃的液氮中。

1.7 胚胎移植后對(duì)受體牛進(jìn)行妊娠檢查。

1.8 受體母牛分娩。

2 主要器械

檢卵設(shè)備：實(shí)體顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、雙蒸餾水器、高壓滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)干燥箱等。

移植器械：移植槍等。

藥品：PBS液、FSH和HCG、PMSG、甘油、抗生素及消毒液。

其他：胚胎冷凍儀、液氮、液氮罐等。

3 具體操作

3.1 供體牛的超排處理

3.1.1 同期發(fā)情

人為控制母牛發(fā)情周期，使母牛集中發(fā)情，這是胚胎移植必須的方法。具體操作如下：優(yōu)先挑選體格健壯的母牛，對(duì)其進(jìn)行藥物注射達(dá)到催情效果，肌肉注射垂體促卵泡素分4 d注射，每天2次，間隔12 h。第1天8 mL，第2天6 mL，第3天4 mL，第4天2 mL。在第3天追加一針氯前列醇皮劑。促使發(fā)情，配種后第一周對(duì)供體牛和受體牛集中超數(shù)排卵和達(dá)到供體、受體兼發(fā)情同期的目的，有利于提高移植后的受胎率。

3.1.2 超數(shù)排卵和沖胚

牛的卵巢含有幾十萬(wàn)個(gè)卵母細(xì)胞，為此對(duì)供體牛進(jìn)行超數(shù)排卵處理，取出妊娠早期胚胎，增加優(yōu)良供體母牛后代，母牛發(fā)育周期的9～14 d肌肉注射PMSG；刺激卵巢產(chǎn)生額外的卵泡，誘導(dǎo)卵泡排卵，對(duì)超排處理的供體牛輸精2～3次，間隔12 h，保證有足夠的有效精子。根據(jù)供體牛的直腸檢查情況，按照卵巢上黃體、卵泡和卵巢組織的發(fā)育情況，初步預(yù)測(cè)供體母牛的超排反應(yīng)效果，一般黃體直徑約2.5 cm左右發(fā)育好，有彈性，凸起明顯，這時(shí)沖胚。沖胚液配制：沖卵液和胚胎的短期培養(yǎng)液，用改進(jìn)的杜氏磷酸鹽緩沖液，見(jiàn)表1。

表1 改進(jìn)杜氏磷酸鹽緩沖液成分

沖胚：本次采用非手術(shù)法收集胚胎。首先對(duì)牛只進(jìn)行硬膜外麻醉注射，在尾椎和薦椎之間的縫隙注入10 mL的普魯卡因。然后通過(guò)直腸探查，確定左右卵巢上的卵泡發(fā)育大小和數(shù)量，先沖洗卵泡數(shù)量多的一側(cè)（左手做右側(cè)卵巢沖胚，右手做左側(cè)卵巢沖胚）。手指指尖靠攏呈錐形進(jìn)入母牛直腸內(nèi)，掏出直腸內(nèi)多余宿糞，使直腸糞便排空。一只手力度輕緩適度，沿直腸內(nèi)壁找到子宮頸，并使宮頸呈水平，另一只手將帶金屬芯的沖胚管向前推送，在直腸內(nèi)的手準(zhǔn)確摸到?jīng)_胚管，將沖胚管引導(dǎo)插入一側(cè)子宮角，確定好位置，給氣囊充氣（20 mL）。用直腸內(nèi)的手觸摸氣囊，固定沖胚管，抽出金屬芯，先注入50 mL沖胚液，用直腸內(nèi)的手隔著直腸對(duì)子宮角輕輕按摩，同時(shí)觀察并收集回流的胚胎液，反復(fù)多次沖洗，收集足夠的回流液體。此時(shí)借直腸把握，將金屬內(nèi)芯插入沖卵管放氣，并把沖卵管從沖卵側(cè)子宮角抽出，通過(guò)子宮體轉(zhuǎn)向另一側(cè)子宮角，重復(fù)以上操作。

沖胚結(jié)束后，宮腔用20支160萬(wàn)U的青霉素溶解到500 mL的0.9%Nacl中，沖洗宮腔。以避免宮腔感染，影響其后續(xù)的繁殖性能。

3.2 檢胚技術(shù)

在20～25 ℃的無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行操作。

過(guò)濾集卵杯：回收到的沖胚液注入集卵杯過(guò)濾后，倒入畫好方格的平皿中，并用沖胚液沖洗過(guò)濾網(wǎng)2～3次，也倒入平皿中待檢。

檢卵及凈化：用實(shí)體顯微鏡從上到下、從左到右、沿方格線移動(dòng)，做到不漏一處，將找到的胚胎用吸管吸出，并放在裝有沖胚液的平皿中，待全部撿完后，進(jìn)行胚胎的凈化和等級(jí)鑒別。同一供體胚胎放在同一平皿中，做好牛號(hào)和胚胎數(shù)量標(biāo)記。

3.3 胚胎鑒別

將沖胚液中的胚胎，置于高倍顯微鏡下，調(diào)整合適倍數(shù)直到看清胚胎，進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查，結(jié)合受精的日齡，觀察其外形是否清晰，大小一致，均勻度和緊密性。胚胎發(fā)育速度和胎齡相一致為佳。胚胎主要分為3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期：細(xì)胞期（0～5 d）,桑椹胚（5～7 d），囊胚期（6～11 d）。

胚胎分為A、B、C三個(gè)等級(jí)。A級(jí)為卵細(xì)胞分裂紋路清晰，形態(tài)均勻；B級(jí)為卵細(xì)胞分裂紋路清晰，形態(tài)略有變形；C級(jí)為卵細(xì)胞紋路不清晰，形態(tài)分布模糊。A、B級(jí)胚胎留用，C級(jí)棄去，C級(jí)胚胎與正常胚齡相比，發(fā)育遲2 d或2 d以上的，難以繼續(xù)正常發(fā)育。

3.4 胚胎移植

3.4.1 鮮胚植入

供受體母牛做同期發(fā)情，受體牛不做配種，一般選品質(zhì)較差或者品種不受市場(chǎng)歡迎的母牛，發(fā)情天數(shù)和供體母牛發(fā)情時(shí)間不超過(guò)24 h，做鮮胚植入的受體。致密桑葚胚、早期囊胚和囊胚分別植入6、7、8 d的受體母牛。

3.4.2 冷凍胚胎植入

先通過(guò)直腸檢查，受體卵巢發(fā)育情況，確定母牛是否可植入胚胎，再解凍冷凍胚胎，冷凍胚胎解凍后，將細(xì)管內(nèi)的溶液混合靜置，緩慢將移卵管送至黃體側(cè)的子宮角大彎或大彎深處，移植時(shí)動(dòng)作要迅速輕柔準(zhǔn)確。

3.4.3 冷凍胚胎與鮮胚差異

冷凍胚胎可長(zhǎng)期保存，但受胎率比鮮胚低，鮮胚雖受胎率高，但不一定有足夠的受體牛，因次長(zhǎng)期冷凍保存。

結(jié)論：本公司對(duì)3個(gè)品種80頭次超排處理，沖卵獲得胚胎640枚，供體母牛平均每頭回收胚胎8枚，其中可用胚胎6枚。生產(chǎn)優(yōu)良胚胎，冷凍胚胎解凍復(fù)蘇率達(dá)70%，凍胚移植妊娠率達(dá)45%，鮮胚移植妊娠率達(dá)60%。

項(xiàng)目完成后，極大的推動(dòng)了肉牛胚胎生物技術(shù)在本公司的應(yīng)用，加快了種牛繁殖速度，提高了種牛的優(yōu)化能力和母牛的利用率，給公司帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。