張維達，楊康，李自力

(農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，武漢 430070)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起豬的一種繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)的高度接觸性傳染病。病豬和帶毒豬是PRRS的主要傳染源[1]。PRRSV主要侵害90日齡左右的妊娠母豬和21日齡以下哺乳仔豬，且仔豬和育肥豬是主要的貯存宿主[2]。PRRSV能通過接觸[3]、空氣[4]、精液[5]和垂直傳播進行病毒擴散。初次感染PRRSV后病毒在豬體內(nèi)存在時間與其個體差異有關(guān)。1996-2006年間，PRRS在我國呈散發(fā)，很少出現(xiàn)暴發(fā)流行。2006年以后在江西、河南、湖南等省發(fā)生了高致病性藍耳病(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失，所以對PRRSV的流行病學調(diào)查具有重要意義。根據(jù)病毒的抗原性，分離地和基因組差異，PRRSV被分為歐洲型(PRRSV 1型)和北美洲型(PRRSV 2型)兩個經(jīng)典的血清型，代表毒株分別為Lelystad(LV)和VR-2332[6-7]。而Nsp2作為監(jiān)測PRRSV進化和分子流行病學研究的關(guān)鍵蛋白，它是病毒的多功能蛋白，在病毒基因組中具有最高的遺傳多樣性。本研究通過對新疆某規(guī)?；i場疑似 PRRS發(fā)病豬血液中分離獲得 1 株 PRRSV 毒株，經(jīng)Nsp2基因以及全基因組測序鑒定和分析發(fā)現(xiàn)該分離毒株屬于高致病性PRRSV亞群，其全基因組核苷酸序列與GD、TJ、HuN4、JXA1等高致病性毒株屬于同一分支，其同源性在98.4%～99.4%之間，由此確定該分離株為HP-PRRSV。本研究探討了新疆地區(qū)PRRSV分離株的遺傳進化規(guī)律，對PRRSV 在偏遠地區(qū)的監(jiān)測、防控以及對未來豬場PRRS凈化具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 細胞、病料和載體 非洲綠猴腎細胞(Marc-145)由華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院吳斌教授課題組饋贈；臨床血樣于2018年10月采集于新疆某豬場出現(xiàn)呼吸困難、體溫升高的45日保育豬群，經(jīng)抗凝血處理后保存在-80 ℃；PMD-18T克隆載體(批號6011)購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(批號AE29422248)購自Hyclone公司，胎牛血清(批號10270-106)購自Gbico公司；高致病性豬藍耳病活疫苗JXA1-R弱毒疫苗購自武漢科前生物股份有限公司(批號20180711)，由華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)微生物學與免疫學實驗室保存；RT-PCR兩步法試劑盒(R223-01)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖(TSJ001)和DL2000 DNA Marker(TSJ011-100)購自北京擎科生物科技有限公司;凝膠回收試劑盒(批號CW2302M)購自康為世紀有限公司；FITC標記羊抗鼠IgG購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 使用Nsp2鑒定引物[8]對野毒株進行鑒定。根據(jù)GenBank公布的PRRSV GD(EU825724.1)全基因組序列以及PRRSV基因結(jié)構(gòu)(圖1)開放閱讀框順序設(shè)計了12 對擴增 PRRSV 的重疊基因片段引物[9-10](表1)，引物A～H用于擴增ORF1a部分，引物H～K用于擴增ORF1b部分，引物L用于擴增ORF2～4部分，引物M用于擴增ORF5～7部分，引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成。

圖1 PRRSV基因組結(jié)構(gòu)模式圖

表1 PRRSV全基因組擴增引物

1.4 病料處理和RNA的提取 將2.5 mL血樣病料經(jīng)過0.22 μm濾膜進行過濾，該試驗操作均在冰盒上完成。取過濾后的血樣加入 750 μL Trizol 和 200 μL 氯仿，振蕩混勻，室溫靜置，離心 15 min；取 500 μL上清加入等量的異丙醇，顛倒數(shù)次，離心 15 min收集沉淀； 75%酒精洗滌沉淀后，離心 10 min，棄上清，超凈臺室溫靜置20 min，收集沉淀；20 μL DEPC水溶解沉淀即為樣品 RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒的分離 將按照步驟1.4處理且RT-PCR檢測呈陽性的血樣分別接種于長滿單層 Marc-145細胞的6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)。細胞培養(yǎng)板置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)吸附 1 h后棄接種物，并用 1 mL PBS洗1次后每孔補加2 mL含2% FBS的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d。接種后每天觀察細胞狀態(tài)，將出現(xiàn)細胞病變孔凍融后置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 間接免疫熒光實驗 用盲傳三代后出現(xiàn)細胞病變的培養(yǎng)物接種Marc-145細胞,培養(yǎng)48 h后，用 4%的甲醛固定 30 min。甲醇室溫穿透10 min，再用2%的BSA 37 ℃溫箱封閉1 h。使用1∶200稀釋抗 PRRSV GP5蛋白單克隆抗體于37 ℃溫箱孵育1 h，再用1∶500稀釋的 FITC-羊抗鼠 IgG于37 ℃溫箱孵育45 min，用熒光顯微鏡觀察實驗結(jié)果，同時設(shè)正常細胞作為對照。

1.7 RT-PCR擴增與核苷酸測序 通過噬斑實驗將病毒純化后，按照1.4項步驟提取病毒RNA，按照說明書進行RT-PCR擴增。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，連接到 pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落并鑒定。陽性質(zhì)粒交給北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.8 同源性以及遺傳進化分析 采用SeqMan根據(jù)測序結(jié)果進行序列拼接，采用MegAlign和MEGA等生物信息學軟件對分離PRRSV全基因組與GenBank公布的國內(nèi)外毒株的全基因組序列進行核苷酸同源性及遺傳進化分析，使用DNAMAN軟件進行序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離與鑒定

2.1.1 臨床病料的檢測 使用PRRSV Nsp2特異性引物對臨床血樣進行RT-PCR檢測，將3號血樣擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序，片段大小為960 bp。根據(jù)表1中Nsp2基因引物擴增片段大小，判定為高致病性PRRSV陽性(圖2)。

M: DL2000 Marker ；1-3:臨床血樣；4：陰性對照；5：JXA1-R感染的Marc-145細胞M: DL2000 Marker ；1-3: blood clinical samples；4：negative control；5：Marc-145 cells infected by JXA1-R

2.1.2 病毒在Marc-145細胞上的增殖結(jié)果 將檢測呈陽性的血樣經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后接種Marc-145細胞進行增殖培養(yǎng)。感染72 h后，相對于空白對照，接種病料的Marc-145細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變(CPE)，表現(xiàn)為細胞聚集成簇、變圓和脫落(圖3)。

A:正常Marc-145 細胞；B: 接種培養(yǎng)物的Marc-145細胞A:Normal Marc-145 cells ；B: Marc-145 cells infected with culture

2.1.3 間接免疫熒光鑒定 使用鼠抗PRRSV GP5蛋白的單克隆抗體和FITC標記羊抗鼠IgG對感染細胞進行間接免疫熒光鑒定，從圖4中能明顯看到Marc-145細胞接種盲傳三代的細胞培養(yǎng)物后呈綠色，為陽性反應，說明該分離病毒為PRRSV。

A:正常Marc-145細胞；B:接種PRRSV的Marc-145細胞A: Normal Marc-145 cells；B: Marc-145 cells infected with PRRSV isolate

2.2 病毒的全基因組擴增，同源性及遺傳變異分析

2.2.1 病毒的全基因組擴增 將病毒全長約為15.2 kb的全基因組按照參考序列分為13個片段，使用表1中的引物通過RT-PCR進行擴增，擴增結(jié)果如圖5所示。

M:DL5000 Marker;1-13: PRRSV 全基因組片段: M、L、K、J、I、H、G、F、E、D、C、B、AM:DL5000 Marker; 1-13: the fragments of PRRSV complete genome: M, L, K, J, I, H, G, F, E, D, C, B, A

2.2.2 病毒全基因組的同源性比較及遺傳變異分析將拼接完成的全基因組序列與表2中NCBI已經(jīng)公布的PRRSV毒株進行同源性比對以及遺傳進化分析。由遺傳進化樹(圖6A)和同源性比較(圖6B)可以看出，XJ-b分離株屬于PRRSV 2型毒株，與國外分離的美洲株(VR2332)和歐洲株(M96262)位于不同分支，與兩者同源性分別為89.0%和59.9%。XJ-b株與中國的經(jīng)典毒株GM2和NADC30-Like毒株JL580的同源性較低，分別為87.5%和84.3%；與中國的高致病性毒株JXA1、TJ、GD、HuN4等同源性較高，其中與2006年中國暴發(fā)的JXA1毒株同源性為98.9%，與GD株同源性高達99.4%。綜上所述，從全基因組進化分析和同源性比對結(jié)果來看，XJ-b屬于中國的高致病性PRRSV。

表2 PRRSV參考毒株

2.2.3 病毒的Nsp2基因同源性、遺傳進化以及序列比對分析 根據(jù)XJ-b全基因組的分析結(jié)果，將XJ-b的Nsp2基因進行遺傳進化分析(圖7A)和同源性比較(圖7B)，XJ-b與GD株的同源性最高(99.4%)；并且與JXA1、GD株等中國高致病性毒株屬于同一分支，Nsp2基因與全基因組的遺傳進化分析結(jié)果一致。

Nsp2基因核苷酸序列比對分析(圖8A)顯示，XJ-b在Nsp2基因組高變區(qū)堿基缺失的位置和數(shù)量與JXA1、GD、Xju-1等高致病性藍耳病病毒株一致，說明XJ-b為高致病性藍耳病病毒株，這與全基因組的分析結(jié)果一致。此外XJ-b與其他毒株最主要的區(qū)別在于Nsp2基因在基因組5090～5170 bp位置(圖8B紅框處)上有一段63 bp的連續(xù)堿基缺失；在6470～6479 bp位置(圖8C紅框處)之間有5處連續(xù)堿基缺失和4個堿基突變，分別為：6270(G)→ 6274(T)，6471(T)→ 6471(A)，6472(A) → 6472(G)和6474(T)→ 6474(C)。

圖6 XJ-b株全基因組核苷酸序列遺傳進化樹(A)與同源性比較結(jié)果(%)(B)

圖7 XJ-b株Nsp2基因組核苷酸序列遺傳進化樹圖(A)與同源性比較結(jié)果(%)(B)

A, B, C:XJ-b Nsp2基因變異缺失位點A, B, C:The variation and deletion sites of XJ-b Nsp2 gene

3 討論與結(jié)論

PRRS是豬的一種急性病毒性傳染病[11]。我國于1996年首次分離到PRRSV CH-1a株，該病開始在全國蔓延。2006-2007年在我國江西、河南、湖南等省發(fā)生了豬高致病性藍耳病。2014年后出現(xiàn)了較多的NADC30-like毒株，并逐漸成為目前主要的PRRSV流行毒株[12]。但是HP-PRRSV仍然作為PRRS重要的流行毒株之一，經(jīng)常與豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型等混合感染[13-14]，我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)對其防控形勢依然嚴峻。為了研究新疆地區(qū)PRRSV的遺傳變異情況，本次研究采取實驗室診斷方法，從臨床病料中成功分離得到一株P(guān)RRSV，將其命名為XJ-b。為進一步確定該病原及其屬性，經(jīng)全基因組遺傳進化以及同源性分析，XJ-b與JXA1高致病性毒株屬于同一亞群，且與2016年分離的高致病性毒株GD株親緣關(guān)系最高。

不同數(shù)量堿基插入、缺失和突變具有多態(tài)性，是造成PRRSV毒株多樣性和持續(xù)變異的重要原因[15]。為進一步探究XJ-b的遺傳進化規(guī)律，本研究對2006年暴發(fā)的高致病性毒株JXA1和2015年在新疆分離的Xju-1株作了序列比對。XJ-b相對于JXA1 與Xju-1的Nsp2基因，其最主要的區(qū)別是有一段連續(xù)63 bp的堿基缺失，其次在近N端有6處堿基缺失和3個堿基突變。這些缺失和突變可能與病毒的復制和毒力有關(guān)，需要進一步研究。盡管均是從新疆地區(qū)分離，Xju-1與JXA1的Nsp2基因的親緣關(guān)系較近，有99.2%的同源性，而XJ-b與JXA1的同源性為98.8%。除此之外，2015年分離的Xju-1在Nsp2基因中有450 bp的連續(xù)缺失[16]，而XJ-b的Nsp2基因的缺失位置以及缺失數(shù)量都不一樣，所以XJ-b并不是由Xju-1進化而來。另外，從已有的新疆PRRSV流行病學報道來看[17-18]，新疆地區(qū)流行的PRRSV毒株仍然以高致病性藍耳病病毒株為主。從地域相關(guān)性上來看，XJ-b與Xju-1全基因組的同源性只有98.5%，但是與在廣東分離的GD毒株，天津分離的TJ株，武漢分離的WUH3株分別有99.4%、98.9%和98.5%的同源性，說明新疆地區(qū)不同PRRSV毒株之間差異性較大，而這種差異一方面可能是XJ-b與內(nèi)陸地區(qū)流行的PRRSV高致病性毒株重組所造成的，另一方面也可能是由新疆本地的PRRSV毒株進化變異而來，具體情況有待于實驗室對更多新疆地區(qū)的PRRSV分離毒株進行進一步的流行病學調(diào)查。實驗室分子生物學檢測是鑒別不同類型豬藍耳病病毒毒株的最準確方法之一，本研究在一定程度上反映出PRRSV在我國新疆地區(qū)的遺傳進化規(guī)律，相對于中國內(nèi)陸來說，PRRSV在新疆地區(qū)流行的毒株類型相對單一。實驗室鑒別診斷和流行病學調(diào)查對我國養(yǎng)豬業(yè)PRRS的防控與凈化具有重要的指導意義。