周學輝

一、綜述

在生物體系中，Ag+是一種重要的金屬離子，由于Ag+的抗菌活性和它與核酸的相互作用，一直以來很受關注。近期，李濤等報道了一種利用G-四鏈體-hemin DNA酶比色法檢測溶液中Ag+和Cys的方法。這種方法是利用Ag+能夠與DNA二倍體/雙鏈結(jié)構中的兩個錯配胞嘧啶堿基C結(jié)合，形成C-Ag+-C金屬堿基對，使錯配的C-C堿基對更穩(wěn)定，從而增強G-四鏈體-hemin配合物的過氧化物酶活性。這種方法的檢測結(jié)果很好，其中Ag+檢測體系的檢測限可達2.5 nM，但是由于反應體系的最大吸光度值僅為0.08，所以需要靈敏度很高的檢測儀器，同時要求操作技術精準。本工作中，我們設計了一種高靈敏度、高選擇性的Ag+定量檢測方法，但是檢測原理與李濤等報道的方法完全不同。我們的檢測方法是基于Ag+對G-四鏈體結(jié)構的破壞作用。檢測體系吸光信號的差值可達0.45。由于Ag+與Cys具有很強的結(jié)合能力，使被Ag+破壞的G-四鏈體可以重新形成，利用這個過程通過簡單的比色測定可設計一種Cys的靈敏檢測方法。由于Ag+檢測體系和Cys檢測體系在檢測過程中都可以產(chǎn)生較大的信號變化，反應體系顏色的改變能夠用肉眼即可觀察，因此可以設計一種簡單的肉眼檢測Ag+和Cys的方法。

二、儀器與試劑

TC-48/H（t）型基因擴增熱循環(huán)儀（杭州博日科技有限公司）

UV-1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）

Jasco J-820分光偏振計

UB-7 PH酸度計（北京賽多利斯科技儀器有限公司）

TGL-16C高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）

H-1微式混合器（上海強運科技有限公司）

BS124S電子天平（北京賽多利斯科技儀器有限公司）

數(shù)碼相機（尼康）

DNA從上海生工生物技術有限公司定制合成;H2O2，Triton X-100，hemin，Tris（三（羥甲基）氨基甲烷），氨基酸，谷胱甘肽，ABTS，DMSO（二甲亞砜），HAc，KAc，AgNO3，Mg（NO3）2，Cu（NO3）2，Mn（Ac）2，Zn（Ac）2，Cr（NO3）3，Pb（NO3）2，Ni（NO3）2，Co（Ac）2，Cd（NO3）2，F(xiàn)e（NO3）3，Hg（Ac）2，Ca（Ac）2均從Sigma公司購買。純度均為分析純。

DNA溶液的配制：溶于二次去離子水中，寡核苷酸的濃度以單鏈濃度的形式表示，其濃度通過測量260nm處的吸光度再根據(jù)對應的消光系數(shù)計算得到。

hemin溶液的配制：稱取0.01304g的hemin，溶于4mLDMSO中，使用時根據(jù)需要稀釋。

本實驗所用到的核苷酸鏈為：CatG4：5′-TGGGTAGGGCGGGTTG

GGAAA

三、結(jié)果與討論

（一）Ag+和半胱氨酸（Cys）檢測體系的設計

G-四鏈體是由具有連續(xù)G序列的DNA形成的一種特殊的核酸二級結(jié)構，它是由四個鳥嘌呤堿基G通過Hoogsteen氫鍵的配對方式首尾連接構成平面的G-四分體（圖1A），相鄰的G-四分體平面之間又通過-堆積作用而形成的。據(jù)報道，Ag+與鳥嘌呤堿基G之間能夠以螯合的方式結(jié)合（圖1B），而結(jié)合位點恰恰是G-四鏈體中Hoogsteen氫鍵的形成位點。因此，Ag+與鳥嘌呤堿基G的結(jié)合可以阻礙G-四鏈體的形成，從而抑制G-四鏈體-hemin DNA酶的過氧化物酶活性（圖1C）。我們假設如果體系中過氧化物酶活性的降低取決于Ag+的濃度變化，那么就可以設計一種新的檢測Ag+的方法。Ag+具有抗菌活性，其抗菌原理主要是Ag+和硫醇鍵相結(jié)合，從而殺死細菌。Cys是一種生命體內(nèi)常見的含硫氨基酸，通過二硫鍵使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部交聯(lián)。Cys中的巰基（-SH）能夠與Ag+結(jié)合從而抑制了Ag+的活性，因此基于G-四鏈體與Cys對Ag+的競爭，可將上述Ag+的檢測方法進行進一步設計用于Cys的檢測。Cys檢測方法的原理如圖1C所示。Ag+優(yōu)先與Cys結(jié)合，因此Cys能夠?qū)⒐押塑账徭溨信cG堿基絡合的Ag+置換出來，G-四鏈體重新形成，結(jié)果應使檢測體系的過氧化物酶活性增強。如果檢測體系的過氧化物酶活性能夠隨著Cys濃度的增加而增強，那么基于這一反應就可以設計一種新的檢測Cys的方法。為了驗證上述假設是否成立，我們對Ag+和Cys加入前后CatG4的圓二色（CD）光譜的變化進行了比較（圖2），不加Ag+時，CatG4的CD光譜在265nm附近有一個正的吸收峰，表明CatG4形成了平行的G-四鏈體。而加入Ag+后，CatG4的CD光譜信號強度急劇下降，表明CatG4形成的G-四鏈體結(jié)構被破壞，與預期一致。Cys自身沒有CD信號，但是向CatG4/Ag+混合物加入Cys后，CD信號明顯增強，這表明G-四鏈體結(jié)構又重新形成。然后向上述溶液中分別加入hemin后再做CD光譜，CD光譜的吸收峰與不加hemin的基本一致，這表明hemin的存在與否對Ag+和CatG4的相互作用沒有影響。

另外我們還研究了Ag+和Cys對過氧化物酶活性的影響，從圖3A可以看出，hemin自身的過氧化物酶活性很弱，而CatG4與hemin形成的配合物具有很強的過氧化物酶活性，能夠有效的催化H2O2氧化ABTS的反應，反應產(chǎn)物ABTS˙+在422nm處有最大吸收。同時，反應混合物呈現(xiàn)特征綠色。向CatG4溶液中加入Ag+（終濃度為3μM）后，體系的吸光信號急劇下降，幾乎與背景吸收值接近，反應混合物基本無色。2μM Cys的加入使體系的過氧化物活性明顯提高。這一實驗現(xiàn)象與圖1C所示反應原理完全吻合。本工作中采用的是ABTS-H2O2的反應體系，Ag+的加入導致吸收信號降低了將近0.45，這個變化通過肉眼就可以觀察到（圖3B）。因此，利用這個結(jié)果可以開發(fā)一種簡單的肉眼檢測Ag+和Cys的方法。