王梓良，鐘一鳴，王小萍，周愛琴，曾石秀

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西 贛州 341000)

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性的病理改變，是心血管疾病最主要的病因，高血脂與炎癥反應(yīng)被認為是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素[1-2]。隨著社會的進步、生活方式的改變和人口老齡化進程的加速，動脈粥樣硬化的發(fā)病率呈現(xiàn)上升和年輕化的趨勢[3]。心血管疾病不僅嚴重影響我國居民的健康和生活質(zhì)量，而且對家庭和社會造成嚴重的經(jīng)濟負擔[4]。 動脈粥樣硬化是系統(tǒng)性、進展性疾病。隨著發(fā)病率及死亡率逐年上升，動脈粥樣硬化常可有誘發(fā)急性心血管事件，如急性心肌梗塞、主動脈夾層等，嚴重危及生命，因而對動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展的研究極其重要[5]。因此，積極干預(yù)動脈粥樣硬化對防治心血管病具有重要的意義。本實驗通過觀察羅格列酮對動脈粥樣硬化的影響，來探討羅格列酮對動脈粥樣硬化的影響及其可能的機制，為抗動脈粥樣硬化治療提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1材料與試劑清潔型SD大鼠均購置南方醫(yī)科大學實驗動物中心[許可證編號：SCXK(粵)2016-0041]，大鼠均為8周齡，雄性，體重240～260 g，羅格列酮片購置上海畢得醫(yī)藥科技有限公司，鼠抗PPARγ多克隆抗體、鼠抗PCNA單克隆抗體、大鼠α平滑肌肌動蛋白抗體、鼠抗人PDGF-B多克隆抗體均購置武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒購置廣州寶匯生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組50只SD大鼠隨機分為5組，每組各10只，Ⅰ 組：正常對照組；Ⅱ 組：正常對照組+低劑量羅格列酮(3 mg·kg-1·d-1) ；Ⅲ組：模型組；Ⅳ組：模型組+低劑量羅格列酮 (3 mg·kg-1·d-1) ；Ⅴ組：模型組+高劑量羅格列酮 (9 mg·kg-1·d-1)。

1.2.2主動脈粥樣硬化模型制作[6]及給藥方法SD大鼠實驗分組后，Ⅰ和Ⅱ組繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組大鼠連續(xù)3 d腹腔注射維生素D360萬IU·kg-1·d-1，并給予高脂飼料飼養(yǎng)(高脂飼料：1%膽固醇、0.1%丙硫氧嘧啶片、0.5%膽酸鈉、3%豬油、5%白糖、3%香油、87.4%基礎(chǔ)飼料)；Ⅰ和Ⅱ組給予等體積生理鹽水腹腔注射，普通飼料飼養(yǎng)。從第4周后開始，Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ組開始用上述兩種劑量羅格列酮治療8周(每天給低劑量羅格列酮及高劑量羅格列酮加0.2 mL生理鹽水灌胃)。于第12周末處死動物并留取標本。

1.2.3測定血清中血脂水平從第0周(實驗開始前)和第12周末(試驗結(jié)束時)這兩個時間段于清晨空腹從大鼠鼠尾靜脈采集血液1 mL，用全自動生化儀測定總膽固醇(TC)、低密度脂蛋自膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)的水平。

1.2.4動物處死及標本留取10%水合氯醛0.04 mL·10 g-1體重腹腔注射麻醉，剖開胸腔與腹腔，腹主動脈取血室溫放置2小時1 000 g離心20分鐘，取上置-20 ℃保存。 主動脈標本留?。喝⊥暾鲃用}(從主動脈根部至髂總動脈分叉處)， 取3 mm主動脈以4%多聚甲醛固定，其余部分置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5組織病理學形態(tài)觀察(1)主動脈油紅“O”染色：取油紅“O”0.5 g，加入異丙醇100 mL，充分溶解后避光貯存。染色時，取油紅“O”溶液60 mL，加蒸餾水40 mL稀釋，靜置5分鐘。將主動脈弓和胸主動脈全段浸入稀釋液10分鐘，轉(zhuǎn)入70%酒精分色15分鐘，自來水沖洗。數(shù)碼相機拍照。應(yīng)用Motic Images Advanced 3.0圖像分析軟件測定斑塊面積與內(nèi)膜面積比。(2)HE染色:每一標本取3張切片(普通玻片)作HE染色,每試驗分組在HE染色片上隨機選取10個視野測定內(nèi)膜厚度。

1.2.6免疫組織化學法測定過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、增殖細胞核抗原(PCNA)、血小板源性生長因子-B(PDGF-B)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)每一標本取3張切片(防脫玻片)，步驟參照免疫組化試劑盒說明書進行。用Motic Images Advanced 3.0 圖像分析軟件測定陽性產(chǎn)物的灰度值進行定量分析，每張切片40倍物鏡下隨機選取5個高倍視野計算平均值。

1.2.7 RT-PCR檢測PPARγmRNA、PDGF-BmRNA及內(nèi)參照GAPDHmRNA (1)引物合成：①PPARγ 擴增產(chǎn)物片斷：201bp，上游引物：5' TGG GGA TGT CTC ATA ATG CCA 3'，下游引物：5' TTC CTG TCA AGA TCG CCC TCG 3'；②PDGF-B 擴增產(chǎn)物片斷：259bp，上游引物：5' AGG AGG CCC ATC TAC ATC ATC ACC GAG T 3'，下游引物：5' CCT TTC ATG TCC AGC CAT GGG CCA CGT 3'；③GAPDH 擴增產(chǎn)物片斷：476 bp，上游引物：5' GAG CTG AAC GGG AAA CTC AC 3'，下游引物：5' GGT CTG GGA TGG AAA CTG TG 3'。 (2)組織總RNA抽提：參照Trizol RNA 提取試劑盒說明書(Gibco 公司)的流程提取組織總RNA。(3)RT-PCR：參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)說明書進行。 (4)電泳及圖像分析：應(yīng)用Imagemaster VDS-CL對凝膠成像，計算PCR產(chǎn)物電泳條帶灰度積分，并以GAPDH的灰度積分進行標準校對。目標基因PCR產(chǎn)物的相對量=目標基因電泳條帶灰度積分/GAPDH電泳條帶灰度積分。

2 結(jié) 果

2.1羅格列酮對血脂變化的影響如表1所示，大鼠經(jīng)處理12周后血脂發(fā)生變化，模型組與正常對照組相比，血脂有明顯升高(P<0.01)；模型組+低劑量羅格列酮組、模型組+高劑量羅格列酮組與模型組相比較， TG明顯降低(P<0.01)、HDL-C明顯升高(P<0.01)；模型組+高劑量羅格列酮組與模型組+低劑量羅格列酮組相比較，TG進一步下降(P<0.05)，HDL-C進一步升高(P<0.05)。表明羅格列酮治療可顯著降低TG水平，升高HDL-C水平。

表1 第12周各組血脂水平比較

注：與正常對照組比較：﹡P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，▲P<0.01；與模型組+低劑量羅格列酮組比較：□P<0.05。

2.2羅格列酮對主動脈粥樣硬化的影響

2.2.1各組主動脈斑塊油紅“O”染色如圖1所示，大鼠經(jīng)處理12周后，正常對照組及正常對照組+低劑量羅格列酮組大鼠主動脈內(nèi)膜光滑，未見粥樣斑塊形成；模型組有嚴重的動脈粥樣硬化病變，斑塊融合成片，向管腔凸出；模型組+低劑量羅格列酮組斑塊部分融合成片狀，斑塊減輕；模型組+高劑量羅格列酮組斑塊明顯減少。

2.2.2各組HE染色如圖2所示，正常對照組及及正常對照組+低劑量羅格列酮組血管內(nèi)膜光滑，排列整齊；模型組血管內(nèi)膜不均勻明顯增厚，斑塊突向管腔，導(dǎo)致管腔變小，內(nèi)膜中含有大量的泡沫細胞；模型組+低劑量羅格列酮組內(nèi)膜增厚較病理對照組減輕，斑塊減少，未見管腔阻塞；模型組+高劑量羅格列酮組內(nèi)膜較均勻增厚，未見明顯泡沫細胞浸潤。

2.2.3各組斑塊面積及內(nèi)膜厚度測定如表2所示，模型組+低劑量羅格列酮組及模型組+高劑量羅格列酮組與模型組相比較，斑塊面積明顯減少(P均<0.01)，模型組+高劑量羅格列酮組與模型組+低劑量羅格列酮組相比較，斑塊面積減少(P<0.05)。模型組+低劑量羅格列酮組及模型組+高劑量羅格列酮組與模型組相比較，內(nèi)膜厚度明顯減少(P均<0.01)，模型組+高劑量羅格列酮組與模型組+低劑量羅格列酮組相比較，內(nèi)膜厚度減少，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 各組主動脈斑塊油紅“O”染色

圖2 各組HE染色結(jié)果(×100倍)

組別 斑塊面積百分比/%內(nèi)膜/μm正常對照組03.15±0.60正常對照組+低劑量羅格列酮組03.15±0.60模型組81.3±3.41271.0±32.1模型組+低劑量羅格列酮組48.3±6.31▲185.2±21.6▲模型組+高劑量羅格列酮組16.3±3.12▲□143.1±20.3▲

注：與模型組比較：▲P<0.01；與模型組+低劑量羅格列酮組比較：□P<0.05。

2.3羅格列酮對PPARγ、PDGF-B、PCNA、α-SMA蛋白表達的影響

2.3.1 PPARγ蛋白表達如圖3所示，模型組與正常對照組相比較，PPARγ陽性細胞率較高，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；模型組+低劑量羅格列酮及模型組+高劑量羅格列酮組與模型組比較，PPARγ陽性細胞率較低(P<0.01)，但仍明顯高于正常對照組(P<0.01)；模型組+高劑量羅格列酮組與模型組+低劑量羅格列酮組相比較，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。表明動脈粥樣硬化病變處PPARγ蛋白表達明顯增加，羅格列酮干預(yù)治療可抑制PPARγ蛋白表達。

2.3.2 PDGF-B蛋白表達如圖4所示，模型組與正常對照組比較，PDGF-B蛋白表達明顯增多，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；模型組+低劑量羅格列酮及模型組+高劑量羅格列酮組與模型組相比較，PDGF-B蛋白表達明顯減少(P<0.01)，但仍高于正常對照組(P<0.01)；模型組+高劑量羅格列酮組與模型組+低劑量羅格列酮組比較，PDGF-B蛋白表達進一步降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。表明羅格列酮干預(yù)治療可使PDGF-B蛋白水平降低。

圖3 PPARγ陽性細胞率(%)

圖4 各組PDGF-B平均灰度值

2.3.3 α-SMA蛋白表達如圖5所示，模型組與正常對照組比較，α-SMA蛋白表達明顯較少(P<0.01)；模型組+低劑量羅格列酮及模型組+高劑量羅格列酮組與模型組比較，α-SMA蛋白表達明顯增高(P<0.01)，但仍低于正常對照組(P<0.01)。表明羅格列酮干預(yù)治療可抑制動脈粥樣硬化中血管平滑肌細胞(VSMCs)的增殖。

2.3.4 PCNA蛋白表達如圖6所示，模型組與正常對照組相比較，PCNA陽性細胞率明顯增高(P<0.01)；模型組+低劑量羅格列酮及模型組+高劑量羅格列酮組與模型組比較，PCNA陽性細胞率明顯下降(P<0.01)，但仍高于正常對照組(P<0.01)；模型組+高劑量羅格列酮組與模型組+低劑量羅格列酮組比較，PCNA細胞陽性率進一步下降(P<0.01)。表明羅格列酮干預(yù)治療可抑制動脈粥樣硬化中血管平滑肌細胞(VSMCs)的PCNA表達。

圖5 各組α-SMA平均灰度值

圖6 PCNA陽性細胞率(%)

2.3.5 PDGF-B與PCNA、α-SMA蛋白表達相關(guān)性分析PCNA表達與PDGF-B表達呈顯著正相關(guān)(r=0.932，P<0.01)，α-SMA 表達與PDGF-B表達呈顯著負相關(guān)(r=-0.748，P<0.01) 。

2.4羅格列酮對PPARγ、PDGF-BmRNA表達的影響

2.4.1 PPARγmRNA表達如表3所示，模型組與正常對照組比較，PPARγ mRNA表達明顯增高(P<0.01)；模型組+低劑量羅格列酮及模型組+高劑量羅格列酮組與模型組比較，PPARγ mRNA表達下降(P<0.01)，但仍明顯高于正常對照組(P<0.01)；模型組+高劑量羅格列酮組與模型組+低劑量羅格列酮組比較，PPARγ mRNA表達進一步降低(P<0.05)。

2.4.2 PDGF-BmRNA表達如表3所示，模型組與正常對照組比較，PDGF-B mRNA表達明顯增高(P<0.01)；模型組+低劑量羅格列酮及模型組+高劑量羅格列酮組與模型組比較，PDGF-B mRNA表達明顯降低(P<0.01)，但仍高于正常對照組(P<0.01)；模型組+高劑量羅格列酮組與模型組+低劑量羅格列酮組比較，PDGF-B mRNA表達進一步下降(P<0.01)。表明羅格列酮干預(yù)治療能明顯降低動脈粥樣硬化中血管PDGF-B表達。

表3 各組血管組織PPARγ、PDGF-B mRNA表達比較

注：與正常對照組比較：﹡P<0.01；與模型組比較：▲P<0.01；與模型組+低劑量羅格列酮組比較：□P<0.05，■P<0.01。

3 討 論

噻唑烷二酮類藥物(TZDs)是一種新型的胰島素增敏劑,其藥理作用主要是通過激活脂肪組織的過氧化物酶體增殖活化受體γ(PPARγ),減少游離脂肪酸的生成，改善胰島β細胞功能，羅格列酮和吡格列酮已廣泛用于胰島素抵抗和二型糖尿病的治療[7]。過氧化物酶體增殖激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)屬于核內(nèi)激素受體家族成員，也是一種轉(zhuǎn)錄因子，PPARγ能被過氧化物酶體增殖物激活而表達,表現(xiàn)為多種生物學功能，PPARγ在抗動脈粥樣硬化、降血脂過程起著一定作用[8]。

在我們實驗研究中,模型組PPARγ mRNA及蛋白水平均顯著高于正常對照組，在用羅格列酮治療后，干預(yù)治療組動脈粥樣硬化病變較模型組減輕，同時PPARγ mRNA及蛋白表達水平也下降，這與Marx，Delerive 等研究亦發(fā)現(xiàn)PPARγ在動脈粥樣硬化處表達明顯增加一致[9]，表明PPARγ在動脈粥樣硬化中可能參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。另外，大鼠血脂水平在高脂喂養(yǎng)后均較正常對照組升高顯著，表明大鼠的血脂代謝紊亂，其中以模型組最為嚴重，而通過羅格列酮治療后TG明顯下降，HDL-C顯著升高，表明羅格列酮激活PPARγ，改善血脂代謝紊亂。有研究顯示，羅格列酮有顯著降低2型糖尿病患者中的TG水平，提高HDL-C水平[10-11]。

在本實驗研究中，模型組與正常對照組相比，α-SMA明顯下降，而羅格列酮治療組與模型組相比，α-SMA顯著升高，表明羅格列酮治療可抑制動脈粥樣硬化中VSMCs增殖。有研究顯示，曲格列酮激活PPARγ后，調(diào)動誘導(dǎo)VSMCs產(chǎn)生收縮表型，抑制VSMCs的增殖，在心血管疾病中起保護作用[12-13]。另外在本實驗研究中，PDGF-B的表達和PCNA的表達呈顯著正相關(guān)，而PDGF-B的表達與α-SMA的表達呈顯著負相關(guān)，表明在動脈粥樣硬化中PDGF-B合成和分泌增加，而羅格列酮干預(yù)治療可以抑制PDGF-B的表達，從而抑制PCNA表達，增加α-SMA表達，從而在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。