沈張平 王欽君 季沈杰

微小RNA(microRNA，miRNA)屬于非編碼RNA，對靶基因的轉錄和蛋白翻譯的過程中發(fā)揮顯著作用[1]。既往研究報道顯示[2-3]，miRNA參與了多種腫瘤細胞的分化、局部浸潤、轉移及凋亡，因此，miRNA也有可能作為腫瘤的血清標志物之一。miR127-3P作為一種小分子的非編碼RNA，在乳腺癌患者血漿和組織中的表達顯著升高，并可作為乳腺癌的一個篩查指標[4]，miR127-3P不僅與乳腺癌有關，也參與了膠質母細胞瘤[5]、卵巢癌[6]等發(fā)病機制，但目前關于肝癌與miR127-3P的相關性研究較少。本研究通過RT-PCR法探討肝癌患者血清miR127-3P的相對表達量及評估其在診斷肝癌中的臨床效能。

資料與方法

一、一般資料

回顧性收集2016年1月1日—2018年6月1日于我院就診的95例原發(fā)性肝癌患者、35例乙肝肝硬化患者、30例慢性乙型肝炎患者及30例健康體檢者血清。原發(fā)性肝癌及慢性乙型肝炎診斷標準符合“原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)及病毒性肝炎防治方案”[7-8]；乙肝肝硬化診斷依據為“既往乙型肝炎病史多年，現肝臟肝硬化通過B超或CT確診”。原發(fā)性肝癌患者男51例，女44例，平均年齡(54.63±11.25)歲；乙肝肝硬化組患者男16，女19，平均年齡(51.28±9.55)歲；慢性乙型肝炎患者男14例，女16例，平均年齡為(49.25±12.11)歲；對照組男女各15例，平均年齡(55.64±10.66)歲。上述研究對象均知情同意且簽署知情同意協(xié)議書，本研究經過我院倫理委員會批準。

二、研究方法

(一)血清標本收集 清晨空腹抽取95例肝癌患者、35例肝硬化患者、30例慢性肝炎患者和30例健康體檢者外周靜脈血3 mL于試管中，靜置20 min后于轉速為8 000 r/min的4℃離心機中離心10 min，為去除殘余細胞成分，取上層血清轉移至另一試管中，再次于轉速為13 000 r/min的4℃離心機中離心10 min，最后取500 μL血清轉移至無RNA酶的EP管中分裝，放入-80℃冰箱保存。

(二)總RNA提取及濃度測定 取出樣本后快速置于37℃水浴鍋中解凍，每管加入700 μL Trizol后震蕩并靜置3 min，再加入0.2 mL氯仿震蕩并靜置3 min，離心后取上層水相于新的無RNA酶的EP管中，再次加入等體積異丙醇混合靜置并離心除去上清液，使用1 mL 75% DEPC酒精洗滌沉淀并室溫干燥，最后加入25 μL DEPC處理的ddH2O水溶解RNA。總RNA濃度采用紫外分光光度計測定其吸光度(A260/A280)，當A260/A280值為1.8～2.2后繼續(xù)下一步實驗。

(三)逆轉錄和實時熒光定量-PCR 按照逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應(miScript II RT逆轉錄試劑盒，德國QIAGEN公司)，反應體系為：miScriptHispct(5x)4 μL，miScriptNucleics(10x)2 μL，miScript Reverse Transcriptase 2 μL，RNA模板12μL。逆轉錄條件：37℃ 60 min，95℃ 10 min。最后加入80μL ddH2O水稀釋。按照試劑盒進行qPCR反應(miScript SYBR Green試劑盒，德國QIAGEN公司)，反應體系10μL：預加熱95℃，30 min，變性94℃，15 s，退火55℃，30 s，延伸70℃，30 s，一共40個循環(huán)。Ct值為反應孔的熒光信號達到設定閾值的循環(huán)數。采用U6作為內參，血清中miR127-3P的相對表達量為2-△Ct=CtmiR-127-3P-CtU6。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計學軟件進行數據處理，所有指標不符合正態(tài)分布，以中位數和四分位數表示，兩樣本比較采用Mann-Whitney檢驗；Pearson相關分析原發(fā)性肝癌患者血清miR127-3P相對表達量與AFP的相關性，并采用logistic回歸分析原發(fā)性肝癌患者miR127-3P相對表達量的影響因素。利用ROC曲線分析miR127-3P相對表達量鑒別原發(fā)性肝癌與乙肝肝硬化、慢性乙型肝炎及健康對照組的臨床效能，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、 原發(fā)性肝癌組、乙肝肝硬化組、慢性乙型肝炎組及健康對照組血清miR127-3P的表達

原發(fā)性肝癌組、乙肝肝硬化組、乙型肝炎組及對照組血清miR127-3P相對表達量中位數及四分位數分別為0.60(0.50～0.63)，0.46(0.41～0.51)、0.29(0.2～0.46)、0.25(0.21～0.31)，任何兩組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其中原發(fā)性肝癌組血清miR127-3P相對表達量顯著高于乙肝肝硬化組、慢性乙型肝炎組及對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(統(tǒng)計量分別為-5.768、-6.120、-7.369，P均<0.05)。

二、 原發(fā)性肝癌組血清AFP與miR127-3P相對表達量的相關性

95例原發(fā)性肝癌患者血清AFP為83.28±22.63 ng/mL，Pearson相關分析結果顯示，原發(fā)性肝癌患者血清AFP與miR127-3P相對表達量呈顯著正相關性(r=0.868，P=0.000)。結果見圖1。

圖1 原發(fā)性肝癌組血清AFP與miR127-3P相對表達量的相關性分析

三、 血清miR127-3P的相對表達量在不同臨床特征原發(fā)性肝癌患者中的差異

單因素分析結果顯示，血清miR127-3P的相對表達量在病程時間、腫瘤細胞分化程度、有無遠處轉移、TNM分期及病灶數目等存在顯著差異(均P<0.05)，原發(fā)性肝癌患者病程時間越長、腫瘤細胞分化程度越低、存在遠處轉移、TNM分期越高及病灶數目多發(fā)，血清miR127-3P的相對表達量越高。具體結果見表1。

表1 不同臨床特征原發(fā)性肝癌患者血清miR127-3P的相對表達量的比較

四、 原發(fā)性肝癌患者血清miR127-3P的相對表達量的影響因素

logistic分析結果顯示，腫瘤細胞分化程度越低(OR=3.236)、TNM分期越高(OR=4.369)、存在遠處轉移(OR=5.687)均是原發(fā)性肝癌患者血清miR127-3P的相對表達量升高的危險因素，具體結果見表2。

表2 原發(fā)性肝癌患者血清miR127-3P相對表達量的影響因素

五、 原發(fā)性肝癌組血清miR127-3P的相對表達量鑒別乙肝肝硬化、慢性乙型肝炎及健康對照組的臨床效能

ROC曲線結果顯示，miR127-3P的相對表達量鑒別原發(fā)性肝癌與乙肝肝硬化的曲線下面積為0.829(95%CI：0.755～0.903)，當截斷值為0.535時，此時敏感度和特異度分別為68.4%和94.3%；miR127-3P的相對表達量鑒別原發(fā)性肝癌與慢性乙型肝炎的曲線下面積為0.870(95%CI：0.783～0.957)，當截斷值為0.445，此時敏感度和特異度分別為91.6%和73.3%；miR127-3P的相對表達量鑒別原發(fā)性肝癌與健康對照的曲線下面積為0.945(95%CI：0.891～0.999)，當截斷值為0.410，此時敏感度和特異度分別為91.6%和90%。結果見圖2～4。

圖2 miR127-3P的相對表達量鑒別原發(fā)性肝癌與乙肝肝硬化的ROC曲線

圖3 miR127-3P的相對表達量鑒別原發(fā)性肝癌與慢性乙型肝炎的ROC曲線

圖4 miR127-3P的相對表達量鑒別原發(fā)性肝癌與健康對照的ROC曲線

討 論

miRNA屬于非編碼RNA，近年來發(fā)現其在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著促進或抑制作用，血液中多種類型的miRNA對于肝癌的早期診斷已經成為研究熱點[9]。miR 127基因位于人類染色體14q32.31上，miR127-3P和miR127-5P屬于兩個成熟的miR127基因前體[10]，既往研究認為，血清miR127-3P在伴有KRAS突變的直腸癌患者[11]存在高表達，國內學者[4]發(fā)現乳腺癌患者癌組織和血清中miR127-3P表達均顯著上調，且與腫瘤標志物CA153呈顯著正相關性(r=0.786，P=0.000)，提示miR127-3P發(fā)揮著促癌作用；但蔣華蔚[5]研究發(fā)現，miR127-3P在神經膠質母細胞瘤患者癌組織中表達下調，主要與miR127-3P誘導細胞G1期阻滯、抑制原癌基因SKI的激活從而抑制了神經膠質母細胞瘤細胞的增生；Wang D等[12]發(fā)現，miR127-3P能通過抑制ITGA6基因從而抑制骨肉瘤細胞的增殖與轉移，故而miR127-3P對腫瘤起到促進或抑制作用存在差異。目前為止，關于肝癌患者血清中miR127-3P的表達是否存在異常及能否作為肝癌的血清學標志物現尚不清楚，本研究通過對95例肝癌患者的外周血miR127-3P進行檢測后發(fā)現，肝癌患者血清中miR 127-3P表達上調，且相對表達量顯著高于乙肝肝硬化及慢性乙型肝炎患者，同時與AFP呈現顯著正相關性，考慮miR127-3P可能作為肝癌的血清學標志之一。為進一步明確miR127-3P診斷肝癌的臨床效能，我們采用ROC曲線分析后發(fā)現，miR127-3P在鑒別肝癌和乙肝肝硬化的臨床效能較高，曲線下面積為0.829(95%CI：0.755～0.903)，當截斷值為0.535時，敏感度和特異度分別為68.4%和94.3%，這提示我們檢測miR127-3P的表達對乙肝肝硬化患者是否進展到肝癌具有指導意義，同時miR127-3P也可作為肝癌的一個血清學標志物。進一步通過logistic回歸分析miR127-3P相對表達量的影響因素結果發(fā)現，當肝癌患者的分化程度越低、TNM分期越高及存在遠處轉移時均是miR127-3P相對表達量上調的危險因素，這也進一步驗證miR127-3P與腫瘤的發(fā)生及轉移可能有關。

綜上所述，肝癌患者血清中miR127-3P表達顯著上調，可作為肝癌的一個血清學指標，且與腫瘤的轉移具有一定聯(lián)系，這也為miR127-3P將來是否可以作為肝癌治療的一個作用靶點提供思路。但本研究的局限性在于未探討miR127-3P促進肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制，同時肝癌患者癌組織中miR127-3P的表達量是否上調仍值得以后進一步探討。