羅 瑩，張建國(guó)，劉曉霞，饒國(guó)棟＊，陸 海

(1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

微管（Microtubule）是由 α-微管蛋白（αtubulin，TUA）和 β-微管蛋白 (β-tubulin，TUB)以異二聚體的形式聚合成的中空管狀結(jié)構(gòu)，它與微絲（Microfilament）和中間纖維（Intermediate filament）共同組成了細(xì)胞骨架。微管蛋白是高度保守的，植物、動(dòng)物、原生生物和真菌中的TUA和TUB蛋白具有高達(dá)88%的序列相似性[1-2]。迄今為止，人們已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)6個(gè)TUA蛋白和9個(gè)TUB蛋白[3]；在水稻中發(fā)現(xiàn)4個(gè)TUA蛋白[4]和8個(gè)TUB蛋白[5]；在毛果楊中有8個(gè)TUA蛋白和20個(gè)TUB蛋白[6]。

微管對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有著重要作用，研究表明，微管影響細(xì)胞形態(tài)發(fā)生，并最終影響植物的形態(tài)。Abe等[7]發(fā)現(xiàn),擬南芥中 TUA6和 TUA4突變體lefty1和lefty2出現(xiàn)左旋生長(zhǎng)的現(xiàn)象,其中,包括lefty1和lefty2雙突變體幼苗下胚軸螺旋生長(zhǎng)，根伸長(zhǎng)區(qū)的徑向細(xì)胞擴(kuò)增，周質(zhì)微管排列比野生型更加片段化且不對(duì)齊。在雙突變體植株中，花絲細(xì)胞的各向異性生長(zhǎng)受到嚴(yán)重?fù)p害。微管和微絲骨架的動(dòng)態(tài)變化還參與了細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)[8]。在擬南芥中，短期的低溫會(huì)影響有絲分裂末期的徑向微管列陣的形成，從而導(dǎo)致二倍體和多倍體花粉的產(chǎn)生[9]。微管在植物抵御環(huán)境脅迫的過程中也發(fā)揮重要作用。Wang等[10]發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫誘導(dǎo)下擬南芥周質(zhì)微管發(fā)生解聚和重組，提出周質(zhì)微管在植物對(duì)鹽脅迫的耐受性中發(fā)揮重要作用。此外，微管在信息傳遞[11]、纖維素微纖維沉積和木材形成[6,12]，調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)[13]等方面具有重要功能。

目前，林木微管蛋白功能的研究鮮有報(bào)道，特別是微管調(diào)控林木形態(tài)與材性分子機(jī)制的研究尚屬空白。研究微管功能首先要對(duì)活體材料進(jìn)行微管的形態(tài)觀察，而現(xiàn)在缺乏林木微管研究的轉(zhuǎn)基因材料，因此，建立穩(wěn)定遺傳的林木微管標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因株系是首要且重要的。為此，首先要構(gòu)建植物微管熒光表達(dá)載體，且通過瞬時(shí)表達(dá)等方法加以驗(yàn)證。構(gòu)建熒光表達(dá)載體時(shí)，目的基因連接在熒光標(biāo)簽的N’端還是C’端一直存在爭(zhēng)議，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，微管蛋白連接在熒光蛋白C’端時(shí)會(huì)影響轉(zhuǎn)基因植物熒光觀察[14]。本研究以84K楊為材料，克隆獲得84KTUA5和84KTUB16基因，并通過同源重組的方法分別將84KTUA5和84KTUB16基因連接至熒光標(biāo)簽mCherry的N’端和C’端，共構(gòu)建了4種重組載體，并通過煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，驗(yàn)證了重組蛋白的表達(dá)及其產(chǎn)生的熒光信號(hào)，為進(jìn)一步研究楊樹微管功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本氏煙草( Nicotiana benthamiana ) 組培苗由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 載體及主要試劑

大腸桿菌(Escherichia coli)TOP10 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；植物表達(dá)載體pCAMBIA 1300-mCherry購(gòu)自淼靈質(zhì)粒平臺(tái)；EASYspin 植物 RNA 快速提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pTOPO-TA-simple克隆試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；重組酶試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；試驗(yàn)過程中所用的限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自NEB公司；引物的合成和序列的測(cè)定均在北京擎科公司完成；卡那霉素、壯觀霉素、慶大霉素、利福平購(gòu)自北京coolaber科技有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)與分析軟件

本研究中用到的擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)為http://www.arabidopsis.org/；毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)為https://phytozome. jgi.doe.gov/pz/portal.html；核酸和氨基酸序列比對(duì)軟件為BioEdit。

1.4 84K楊TUA5和TUB16基因的克隆

根據(jù)文獻(xiàn)中提供的毛果楊TUA5和TUB16基因編號(hào)[6]，搜索其基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，分別獲得PtTUA5和PtTUB16基因序列。由于微管蛋白在各物種間的保守性很高，因此，本研究以毛果楊的TUA5和TUB16基因?yàn)槟０澹肞rimer軟件設(shè)計(jì)同源引物，用于克隆84K楊的TUA5和TUB16基因。提取84K楊的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行同源克隆，PCR克隆反應(yīng)所用引物84KTUA5-UTR和84KTUA16-UTR的序列信息見表1。

表 1 84KTUA5和84KTUB16的引物Table 1 The primers of 84KTUA5 and 84KTUB16

克隆得到的84KTUA5和84KTUB16基因分別與pTOPO-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含Amp（100 mg·L-1）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用BioEdit軟件與毛果楊的TUA5和TUB16基因進(jìn)行序列比對(duì)。

1.5 植物過表達(dá)載體的構(gòu)建

84KTUA5和84KTUB16與熒光蛋白基因mCheery N’端連接植物表達(dá)載體構(gòu)建的具體步驟如下：雙酶切（KpnⅠ和SalⅠ）pCAMBIA 1300載體，設(shè)計(jì)與載體一致的同源重組引物（表1），PCR擴(kuò)增84KTUA5和84KTUB16基因，利用重組酶clonExperss Mix將擴(kuò)增得到的目的基因連接在pCAMBIA 1300載體mCherry熒光標(biāo)簽的N’端，獲得植物過表達(dá)載體pCAMBIA 1300-84KTUA5-mCherry和 pCAMBIA 1300-84KTUB16-mCherry，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan（50 mg·L-1）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。鑒定采用的上下游引物序列分別來(lái)自于載體和插入基因（表1），篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。

84KTUA5和84KTUB16與熒光蛋白基因mCheery C’端連接植物表達(dá)載體構(gòu)建的具體步驟如下：由于mCherry熒光標(biāo)簽的C’端存在終止密碼子且無(wú)過度序列，為了同時(shí)保證插入蛋白和熒光蛋白形成正確的構(gòu)象，84KTUA5和84KTUB16基因需借助連接肽連接在mCherry熒光標(biāo)簽的C’端。連接肽的序列為 (5’-GGAGGTGGAAGTGGAGGTAGCG GT-3’)，PCR 擴(kuò)增 獲得 linker-84KTUA5和 linker-84KTUB16序列，引物見表1。純化回收后分別與pTOPO-T simple載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp（100 mg·L-1）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定并測(cè)序。采用同源重組的方法將上述序列與pCAMBIA 1300載體連接（酶切位點(diǎn)為BsrG I-HF），獲得植物過表達(dá)載體pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUA5和pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUB16，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan（50 mg·L-1）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，引物見表1，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。載體構(gòu)建過程見圖1。

圖 1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建過程Fig. 1 Construction process of plant expression vector

1.6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，涂布在含有Rif（50 mg·L-1）、Kan（50 mg·L-1）和 Gent（50 mg·L-1）的 LB 固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定并測(cè)序。

1.7 煙草瞬時(shí)表達(dá)和熒光觀察

含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，5 000 rpm離心10 min，收集菌體，配制煙草注射液（10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，pH 5.6），加入 200 μmol·L-1AS（乙酰丁香酮），懸浮菌體，使OD600約為1.0，室溫放置2 h，選取3～4周長(zhǎng)勢(shì)較好的本氏煙草為植物材料，按照Imogen等[15]的瞬時(shí)表達(dá)方法，用注射器將注射液從葉片下表皮注射到煙草葉片內(nèi)（圖2A）。

農(nóng)桿菌侵染48 h后的本氏煙草葉片置于滴有蒸餾水的載玻片上，做成臨時(shí)封片，立即在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片組織的上表皮細(xì)胞。本研究中所用的顯微鏡為Zeiss LSM510倒置激光掃描共聚焦顯微鏡。所用激光器為594 nm氦氖激光器（2 mW），激發(fā)光波長(zhǎng)為594 nm，發(fā)射光接收范圍為630～695 nm。用于圖像采集的顯微鏡物鏡為40×物鏡，數(shù)值孔徑為1.44，針孔大小為1 AiryUnit，掃描分辨率為1 024×1 024。采用Zen軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 84K楊TUA5和TUB16基因的獲得

從克隆產(chǎn)物菌落PCR鑒定結(jié)果（圖3）可以看出：在1 300 bp左右有明顯條帶，與預(yù)測(cè)的目的基因片段大小吻合，初步確定為目的基因片段。測(cè)序結(jié)果顯示：84KTUA5基因CDS序列全長(zhǎng)1 344 bp，編碼448個(gè)氨基酸；84KTUB16基因CDS序列全長(zhǎng)1 356 bp，編碼452個(gè)氨基酸，利用BioEdit軟件對(duì)84K楊與毛果楊中的TUA5和TUB16基因序列進(jìn)行同源比對(duì)（表2），其同源性分別達(dá)98.80%和96.70%。

圖 2 PCR鑒定結(jié)果Fig. 2 PCR identification results

表 2 序列同源性比對(duì)Table 2 Sequences homology alignment %

2.2 重組表達(dá)載體的鑒定

對(duì)4種重組表達(dá)載體pCAMBIA 1300-84KTUA5-mCherry、 pCAMBIA 1300-84KTUB16-mCherry、pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUA5、pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUB16進(jìn)行菌落PCR鑒定。由圖4可以看出：2 200 bp左右有明顯條帶，與預(yù)測(cè)序列大小一致。經(jīng)測(cè)序后，用BioEdit軟件進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明，目的基因已成功插入pCAMBIA 1300-mCherry表達(dá)載體中。

2.3 煙草瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果

激光共聚焦結(jié)果（圖2B）顯示：pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUA5和pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUB16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的煙草葉片上表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上有紅色熒光分布，表明這兩種融合蛋白能夠正確表達(dá)，可以用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；而pCAMBIA 1300-84KTUA5-mCherry和pCAMBIA 1300-84KTUB16-mCherry重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的煙草葉片上表皮細(xì)胞無(wú)法觀察到紅色熒光，說明這兩種融合蛋白未能正確表達(dá)，無(wú)法用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)觀察的是葉片上表皮細(xì)胞，幾乎不含葉綠體，因此，葉綠體自發(fā)熒光對(duì)觀察結(jié)果的影響較小，且由于熒光標(biāo)記的是周質(zhì)微管，因而，只在細(xì)胞邊緣發(fā)現(xiàn)紅色熒光。

圖 3 重組表達(dá)載體PCR鑒定Fig. 3 PCR identification of recombinant expression vectors

圖 4 煙草瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果Fig. 4 Transient expression in tobacco

3 討論

林木遺傳改良的兩個(gè)重要方向：林木材性的遺傳改良和林木形態(tài)的遺傳改良?，F(xiàn)階段，針對(duì)林木材性遺傳改良的研究主要集中在木質(zhì)素及纖維素合成與調(diào)控的分子機(jī)理上[16]，直接研究木質(zhì)素和纖維素合成與調(diào)控的相關(guān)通路及結(jié)構(gòu)基因已成為當(dāng)今的熱點(diǎn)。微管作為纖維素合酶的軌道，指導(dǎo)了纖維素的合成與延伸[12,17]。因此，研究林木微管的結(jié)構(gòu)與功能，解析微管間接調(diào)控林木材性的分子機(jī)理對(duì)林木遺傳改良同樣具有十分重要的意義。林木形態(tài)的改良還主要集中在傳統(tǒng)的選育水平，從分子水平解析林木形態(tài)決定的關(guān)鍵因子顯得尤為重要。微管通過不同的排列方式?jīng)Q定了細(xì)胞的形態(tài)，最終導(dǎo)致了植株的形態(tài)差異，研究微管的結(jié)構(gòu)與功能對(duì)林木的形態(tài)改良同樣具有十分重要的意義。為了彌補(bǔ)研究林木微管功能所需活體材料的空缺，建立穩(wěn)定遺傳的林木微管標(biāo)記的植物材料十分必要。本研究旨在構(gòu)建林木微管功能研究植物表達(dá)載體，并讓其在植物中表達(dá)，為建立微管功能研究林木轉(zhuǎn)基因材料奠定基礎(chǔ)。

高度保守的微管蛋白在物種間具有很高的序列相似性，毛果楊中有8個(gè)TUA蛋白和20個(gè)TUB蛋白，本研究選取了本底表達(dá)量較高的PtTUA5和PtTUB16基因作為模板設(shè)計(jì)引物，同源克隆得到84K楊的84KTUA5和84KTUB16基因，分析結(jié)果顯 示:84KTUA5和 PtTUA5同 源 性 為 98.80%，84KTUB16 和PtTUB16同源性為96.70%，將二者分別與pCAMBIA 1300載體mCherry熒光標(biāo)簽的N’端和C’端進(jìn)行同源重組，構(gòu)建植物過表達(dá)載體。

pCAMBIA 1300系列載體為雙元表達(dá)載體，是目前比較主流并得到廣泛認(rèn)可的植物表達(dá)載體。相比于卡那霉素或草銨膦等抗性基因，pCAMBIA 1300載體在植物中具有的潮霉素抗性更易篩選獲得陽(yáng)性植株。本研究中選用的mCherry為紅色熒光蛋白，為將來(lái)以其他顏色熒光（如GFP/YFP熒光蛋白）研究微管功能提供背景材料。

構(gòu)建的4種重組質(zhì)粒中，目的基因連接在mCherry熒光標(biāo)簽N’端的融合蛋白未能在煙草中成功表達(dá)，推測(cè)原因是融合蛋白沒有正確折疊形成有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。直接將兩種蛋白融合時(shí)常會(huì)導(dǎo)致嵌合的蛋白形成空間位阻，影響蛋白活性，連接肽的引入對(duì)融合蛋白的表達(dá)、活性和穩(wěn)定性有重要作用。連接肽有柔性和剛性之分，柔性連接肽主要由 Gly和 Ser組成，如 Huston等[18]提出的（GGGGS）n（n≤6）序列，剛性連接肽是α螺旋結(jié)構(gòu)的，一般使用的是（EAAAK）n（n≤6）。連接肽的長(zhǎng)度影響融合蛋白的活性和穩(wěn)定性。本研究中設(shè)計(jì)了8個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的柔性連接肽（GGGSGGSG），用于目的基因與mCherry基因的C’端連接，使融合蛋白成功表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究分別構(gòu)建了84K楊TUA5和TUB16基因與pCAMBIA 1300-mCherry的4種融合表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)證實(shí)：目的基因通過連接肽連接在pCAMBIA1300載體mCherry熒光標(biāo)簽C’端的融合表達(dá)載體pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUA5和 pCAMBIA 1300-mCherry-84KTUB16能夠在植株中正確表達(dá)，且能產(chǎn)生較強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)。楊樹微管功能研究植物表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證，為研究微管調(diào)控林木形態(tài)與材性奠定了基礎(chǔ)。筆者將利用以上2種融合表達(dá)載體進(jìn)行楊樹的遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步研究楊樹各個(gè)組織微管形態(tài)的差異。