孫志會，羅聲棟，何澤民，胡燕，宋立華，王景林

1.病原微生物生物安全國家重點實驗室，軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所，北京 100071；2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 臨床研究管理中心，北京 100039

衣原體是專性胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，具有特殊的雙相發(fā)育周期：有傳染性但無代謝活性的原體（EB）進入宿主細胞，并在其中分化為具有代謝活性的網(wǎng)狀體（RB）。沙眼衣原體有15 個血清型，血清型A～C 是導(dǎo)致沙眼和可預(yù)防性失明的主要原因；血清型D～K 主要引起泌尿生殖道的急性和慢性炎癥性疾病，可導(dǎo)致不孕或異位妊娠[1]。沙眼衣原體是性病性淋巴肉芽腫（LGV）的病原體，會引起腹股溝淋巴結(jié)[2]。沙眼衣原體感染多為隱性感染，不及時治療極易引起反復(fù)感染，大大提高宮頸癌發(fā)病率和HIV 的感染風(fēng)險[3]，同時引起盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎和尿道炎等多種并發(fā)癥[4-5]。

研究表明沙眼衣原體的毒力與衣原體質(zhì)粒[6]和染色體CT135 基因[7]等多個毒力因子有關(guān)[8]。在小鼠感染模型中，質(zhì)粒和CT135 基因分別與沙眼衣原體感染的菌體載量和慢性感染相關(guān)[9]。CT135 基因編碼一個有4 個跨膜結(jié)構(gòu)域的假定的包涵體膜蛋白[10]，其功能未知，目前此蛋白在衣原體中的表達尚缺乏報道。本研究以pET-32a（+）為載體，構(gòu)建出C 端帶有His 標簽的重組質(zhì)粒表達CT135 蛋白并制備抗血清，用于建立CT135 蛋白免疫檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

沙眼衣原體 L2（434）、載體 pET-32a（+）由本實驗保存；大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)、BL21（DE3）購自北京全式金公司；高保真DNA 聚合酶、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，DNA 提取試劑盒、一抗（Anti-His 抗體）購自北京全式金公司；二抗［680RD 羊抗鼠 IgG（H+L）］購自 LI-COR 公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ，T4DNA 連接酶購自NEB 公司；Precast-Glgel 變性預(yù)制膠購自上海生工生物科技有限公司；蛋白純化Ni2＋-NTA 親和層析柱購自Clontech 公司；引物由北京博邁德生物技術(shù)有限公司合成；PEQSTAR 2× PCR 儀為peQLab公司產(chǎn)品；Odyssey 雙色紅外掃描儀為LI-COR 公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計與合成

設(shè)計引物對（表1）。以沙眼衣原體L2（434）基因組為模板，用引物對CT135-F/CT135-R 和高保真DNA 聚合酶擴增CT135 基因片段（全長1083 bp）（擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火，72℃延伸 1 min，28 個循環(huán)；72℃終延伸 5 min）。以 pET-32a（+）質(zhì)粒為模板，用引物對pET32a-F/pET32a-R 和高保真DNA 聚合酶擴增pET-32a（+）載體（擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 30 s，57℃退火，72℃延伸 3 min 30 s，28 個循環(huán)；72℃終延伸 5 min）。

1.3 CT135全長重組質(zhì)粒構(gòu)建

用1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，正確大小的PCR 產(chǎn)物用純化試劑盒純化。用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ/XhoⅠ分別對目的片段和載體片段進行雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收后，用T4DNA 連接酶16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1 感受態(tài)，涂板后37℃過夜培養(yǎng)，挑單克隆并用引物對28a5F/28a3R鑒定正確后送博邁德公司測序。測序正確即得到重組質(zhì)粒pET-32a-CT135-His（以下簡稱WT）。

表1 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定的引物

1.4 CT135基因截短重組質(zhì)粒構(gòu)建

以WT 為模板，分別用引物對MT1-F/32aR1、MT2-F/32aR1、MT3-F/32aR1、pET32a-F/MT4-R、pET32a-F/MT5-R、pET32a-F/MT6-R 和 高 保 真DNA 聚合酶擴增CT135 N 端逐漸縮短和C 端逐漸縮短的6 個不同的截短重組質(zhì)粒片段，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ單酶切，切膠純化后用T4DNA 連接酶連接構(gòu)建截短重組質(zhì)粒，分別命名為MT1、MT2、MT3、MT4、MT5、MT6。

1.5 蛋白表達

1.5.1 蛋白取樣 將測序正確的7 個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，取100 μL轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的感受態(tài)涂到含50 μg/mL 氨芐青霉素的平板上，12～14 h 后挑菌于小試管中過夜培養(yǎng)14 h，按 1∶100 的比例轉(zhuǎn)接到 100 mL 含 50 μg/mL 氨芐青霉素的 LB 液中，37℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)至D600nm為 0.8，取樣 1 mL 后加入 0.6 mmol/L IPTG 繼續(xù)培養(yǎng)，之后分別在 0.5、1、2、3、4、5 h 各取樣1 mL。

1.5.2 SDS-PAGE 取樣完成后室溫12 000 r/min 離心 2 min，去上清；加 100 μL PBS 重懸，后加20 μL 6×上樣緩沖液，沸水浴10 min，冰水浴1 min；室溫5000 r/min 離心1 min；預(yù)制膠每個泳道加樣 20 μL，120 V 50 min 蛋白電泳，每個重組質(zhì)粒的蛋白樣品進行2 次SDS-PAGE。

1.5.3 考馬斯亮藍染色和Western 印跡 電泳結(jié)束后，一塊預(yù)制膠用于考馬斯亮藍染色。另一塊預(yù)制膠經(jīng) 80 V、45 min 轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，脫脂奶粉室溫孵育 2 h，PBS 洗 3 次，每次 5 min；以 1∶1000的比例加入一抗（Anti-His），4℃過夜孵育14 h，PBST 洗 5 次，每次 5 min；以 1∶10 000 的比例加入二抗，常溫避光孵育1 h，PBST 洗5 次，每次5 min；經(jīng)Odyssey 雙色紅外成像系統(tǒng)檢測信號。

1.6 抗體制備及檢測

本研究選擇MT6 蛋白表達純化并注射BALB/c 小鼠制備小鼠多抗。將轉(zhuǎn)化有MT6 重組質(zhì)粒的大腸桿菌接種到100 mL LB 液中，經(jīng)37℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)至D600nm為 0.8 時加 IPTG（濃度同上），誘導(dǎo)4 h 后取菌液離心沉淀超聲波破碎，經(jīng)Ni2+-NTA 親和層析柱純化，用40 mmol/L 咪唑去除雜蛋白，300 mmol/L 咪唑洗脫目的蛋白。

取50 μg 純化的重組MT6 蛋白，與弗式完全佐劑按1∶1 的體積比完全乳化后皮下注射小鼠，2周后取25 μg 純化的MT6 蛋白與弗式不完全佐劑按1∶1 的體積比完全乳化后進行二次免疫，2 周后以同樣的方法進行第三次免疫，1 周后小鼠尾靜脈取血，室溫靜置30 min，4℃放置30 min，5000 r/min 室溫離心5 min，收集上層血清。將此血清為一抗、羊抗鼠抗體為二抗進行Western 印跡，經(jīng)Odyssey 雙色紅外成像系統(tǒng)檢測信號。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

以pET-32a（+）質(zhì)粒為骨架連接CT135 基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒 WT、MT1～MT6（圖1）。WT 是有CT135 全長基因的重組質(zhì)粒（圖1A）；MT1～MT3 是CT135 蛋白N 端逐漸縮短的重組質(zhì)粒，MT4～MT6是CT135 蛋白C 端逐漸縮短的重組質(zhì)粒（圖1B）。

2.2 蛋白表達

圖1 重組質(zhì)粒示意圖（A）及各片段電泳圖（B）

考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示，MT6 蛋白相對分子質(zhì)量約為14×103，與實際大小符合；而WT 和MT1～MT5 均觀察不到重組蛋白（圖2A），結(jié)果提示CT135 蛋白在大腸桿菌中表達量低，不利于大量純化制備抗體。Western 印跡顯示所有質(zhì)粒均可表達重組蛋白（圖2B），WT 蛋白相對分子質(zhì)量約為40×103，與實際相符，且蛋白表達量隨時間先增加后減少，4～5 h 后表達量接近本底水平，提示CT135 蛋白表達量低且不穩(wěn)定。而MT1～MT6 截短突變體的小蛋白表達量隨時間出現(xiàn)不同的變化趨勢。其中 MT1、MT2、MT4 和 MT5 結(jié)果類似，蛋白表達量隨誘導(dǎo)時間增加幾乎不變；MT3 和MT6 蛋白表達量隨時間增加而增加，二者不同的是后者的表達量遠遠高于前者，可進行蛋白的大量純化，用于抗體制備。

2.3 多克隆抗體制備及檢測

在所有的重組質(zhì)粒中只有MT6 可以高表達重組蛋白，所以本研究選擇其進行小鼠抗血清的制備。分別取WT 和MT6 蛋白表達0～5 h 的菌液樣品，以實驗制備的小鼠多克隆抗體為一抗，結(jié)果檢測到蛋白大小條帶分別為40×103和14×103（圖3），與 WT 和 MT6 蛋白大小一致。

3 討論

沙眼衣原體CT135 是在衣原體發(fā)育周期的早期表達的質(zhì)粒獨立調(diào)控染色體基因[11]。研究表明沙眼衣原體毒力因子CT135 在體內(nèi)穩(wěn)定，在體外呈多態(tài)性，體外培養(yǎng)過程中CT135 基因發(fā)生缺失突變，且此突變減弱沙眼衣原體血清型D 在雌性小鼠生殖道中的毒力[12]。

CT135 基因編碼重要的毒力因子[6-8]。本研究以 pET32a（+）質(zhì)粒為載體，構(gòu)建 WT 和 MT1～MT6等7 個不同長度的CT135 基因重組質(zhì)粒，建立了CT135 重組表達方法，為后續(xù)探究CT135 蛋白的功能打下了基礎(chǔ)。在大腸桿菌中，隨著誘導(dǎo)時間的延長，CT135 表達量先增加后減少，提示重組CT135 蛋白發(fā)生了降解，純化表達CT135 全長蛋白是急需解決的難題。另外，多個CT135 截短突變體的蛋白表達量也很低，推測這些區(qū)域仍對大腸桿菌有一定的毒性。盡管全長CT135 表達困難，但本研究成功制備了小鼠抗CT135 蛋白N 端的抗血清，為后期檢測衣原體中CT135 的表達奠定了基礎(chǔ)。

圖2 蛋白表達結(jié)果

圖3 抗血清檢測