何家恒，張雨，劉波，施勤，羅宗平

1.蘇州大學(xué) 附屬第一醫(yī)院骨科，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州大學(xué) 骨科研究所，江蘇 蘇州 215006

骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的惡性腫瘤[1]， 起源于間質(zhì)細(xì)胞系，是骨惡性腫瘤中最多見(jiàn)的一種。腫瘤迅速生長(zhǎng)引起全身免疫反應(yīng)的減弱，臨床主要表現(xiàn)為避痛性跛行、關(guān)節(jié)活動(dòng)受限和肌肉萎縮等癥狀，死亡率較高。對(duì)骨肉瘤治療的研究是全球關(guān)注的焦點(diǎn)。目前臨床骨肉瘤治療以手術(shù)治療為主[2]，通過(guò)切除病變部位并結(jié)合放化療達(dá)到根治病變的目的,但是患者將承受巨大的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，并有可能造成嚴(yán)重的家庭及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找一種能夠緩解甚至治愈骨肉瘤的藥物對(duì)于改善骨肉瘤患者的預(yù)后具有重大意義。

多酚類物質(zhì)近年來(lái)被研究者廣泛關(guān)注，研究表明其有著抗菌、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松[3]以及抗腫瘤的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們探討了多酚類物質(zhì)綠原酸[4]對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG63 的增殖、腫瘤細(xì)胞干性、侵襲、遷移及凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人骨肉瘤細(xì)胞株MG63（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院惠贈(zèng)）；高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco 公司）；胎牛血清（Hyclone 公司）；TRIzol 總 RNA 提取液、CCK-8 試劑盒、結(jié)晶紫染色劑（碧云天公司）；綠原酸（Sigma Aldrich 公司）；Transwell 小室（Corning公司）；Annexin-V FITC 凋亡試劑盒（BD Pharmin?geen 公司）；倒置顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器廠）；CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo公司）；流式細(xì)胞儀（Millipore 公司）；熒光定量PCR 儀（Bio-Rad 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法

將人骨肉瘤細(xì)胞株MG63 接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)，采用0.25%的胰酶進(jìn)行細(xì)胞傳代，倒置顯微鏡實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)達(dá)到所需細(xì)胞數(shù)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

用CCK-8 試劑盒檢測(cè)MG63 細(xì)胞的增殖。CCK-8 試劑盒中的WST-8 試劑可以被細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成橙黃色甲臜，細(xì)胞數(shù)目越多則顏色越深。在HDMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基中按10%比例加入CCK-8 溶液混勻后，每孔均勻加入等量上述溶液（96 孔板），37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，轉(zhuǎn)移反應(yīng)后的液體至新的培養(yǎng)板中。用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值，D450nm值與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。

1.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將對(duì)照組及干預(yù)后的細(xì)胞用含2%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，所需細(xì)胞密度為5×105/mL。每塊 24 孔板的 Transwell 上室只加入 100 μL 細(xì)胞懸液，下室加入800 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后取出Transwell 小室，吸去小室中的培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦去小室上層未遷移的細(xì)胞。用PBS 清洗3 次，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用PBS 清洗后在顯微鏡10 倍和40 倍物鏡下觀察，用ImageJ 軟件分析每張照片遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至6 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿。6 孔培養(yǎng)板底預(yù)先用黑筆劃3 條橫線，用200 μL 的槍頭垂直于孔板劃3 條豎線，使其與底部3 條橫線相互垂直。用PBS 洗滌被刮下的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察并拍照。選擇0、12、24 h 為拍攝時(shí)間點(diǎn)，觀察細(xì)胞的遷移面積。

1.6 RT-PCR

用TRIzol 總RNA 提取液提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組MG63 細(xì)胞的總RNA，測(cè)定濃度，將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在PCR 板上加樣擴(kuò)增，依據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量［ΔΔCt=（Ct 靶基因-Ct 內(nèi)參）實(shí)驗(yàn)組-（Ct 靶基因-Ct內(nèi)參）對(duì)照組］。實(shí)驗(yàn)使用的引物序列見(jiàn)表1。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基，PBS 清洗細(xì)胞后用0.25%胰蛋白酶消化貼壁的細(xì)胞，1500 r/min 離心5 min，棄上清后用PBS 洗滌細(xì)胞后離心。用凋亡試劑盒緩沖液重懸細(xì)胞，每管加入5 μL Annex?in-V FITC 及碘化丙啶（PI）染液10 μL，室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品。

表1 引物序列

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用 SPSS13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，全部統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸抑制MG63細(xì)胞增殖

用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示和正常條件生長(zhǎng)的細(xì)胞相比，綠原酸干預(yù)后的第3 d 開始細(xì)胞增殖顯著降低（P＜0.05，圖1）。

2.2 綠原酸抑制腫瘤干性相關(guān)基因的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)所用的MG63 骨肉瘤細(xì)胞的干細(xì)胞的標(biāo)志物包括Sox2 及核干細(xì)胞因子（Nucleostemin）基因。MG63 骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)綠原酸處理5 d 后進(jìn)行基因檢測(cè)，處理組細(xì)胞的腫瘤干性基因較正常生長(zhǎng)細(xì)胞均有不同程度的降低（P＜0.05）（圖2），表明綠原酸處理抑制了MG63 腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。

2.3 綠原酸抑制MG63細(xì)胞侵襲及遷移

圖1 綠原酸對(duì)MG63 細(xì)胞增殖的影響

圖2 綠原酸對(duì)MG63 細(xì)胞腫瘤干性基因Sox2 及 Nucleostemin 表達(dá)的影響

用Transwell 培養(yǎng)板模擬腫瘤細(xì)胞侵襲，比較Transwell 孔的上下室內(nèi)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的一種方式，主要通過(guò)在培養(yǎng)皿上種植的細(xì)胞中劃出一道寬度相同的空隙，來(lái)模擬細(xì)胞在體外遷移的過(guò)程，通過(guò)比較空隙恢復(fù)情況來(lái)確定細(xì)胞的遷移速率。Transwell 結(jié)果（圖3）顯示，實(shí)驗(yàn)組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05），表明綠原酸抑制了MG63 細(xì)胞的侵襲性。劃痕實(shí)驗(yàn)（圖4）中正常生長(zhǎng)細(xì)胞的“傷口”已基本愈合，然而在綠原酸的作用下MG63 細(xì)胞還留有較大空隙，說(shuō)明綠原酸抑制了骨肉瘤MG63 細(xì)胞的遷移性。

2.4 綠原酸下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)MG63細(xì)胞的凋亡

圖3 Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)綠原酸對(duì)MG63 細(xì)胞侵襲性的影響

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)綠原酸對(duì)MG63 細(xì)胞遷移性的影響

綠原酸干預(yù) MG63 細(xì)胞 3 d 后，Bcl-2 的表達(dá)量減少（P＜0.05），而Bax 的表達(dá)則無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖5）。用 PI 染色細(xì)胞核酸，PI 不可透過(guò)細(xì)胞膜，根據(jù)染色情況可判斷膜的完整性，區(qū)分壞死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。PI 和An?nexin-V 聯(lián)合可以分辨活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。圖6 的Q3 區(qū)域?yàn)榈蛲黾?xì)胞陽(yáng)性區(qū)域，此結(jié)果表明綠原酸處理后的細(xì)胞凋亡比例更高（P＜0.05）。

3 討論

骨肉瘤是起源于間充質(zhì)細(xì)胞的具有高度侵襲性的惡性腫瘤，其特征為增殖的腫瘤細(xì)胞直接形成未成熟骨或骨樣組織。目前針對(duì)骨肉瘤的治療方法大多以手術(shù)根治性治療聯(lián)合藥物化療為主，但藥物化療副作用明顯，且腫瘤細(xì)胞易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥[5]，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，限制了患者的預(yù)后生存，因此尋找毒副作用小且不易產(chǎn)生耐藥的物質(zhì)用于治療骨肉瘤，對(duì)于臨床上改善患者預(yù)后具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)中所用的綠原酸是從植物體內(nèi)提取的多酚類物質(zhì)，在一定程度上可避免副作用的發(fā)生。我們通過(guò)研究綠原酸對(duì)人骨肉瘤MG63 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，進(jìn)而探索綠原酸在骨肉瘤臨床治療中的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 綠原酸對(duì)MG63 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

腫瘤干細(xì)胞是一類具有自我更新、無(wú)限增殖和巨大分化潛能的細(xì)胞。當(dāng)腫瘤干細(xì)胞不受控制時(shí)，可以無(wú)限增殖和轉(zhuǎn)移。通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞干性基因的檢測(cè)，可以對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力有初步的判斷。例如對(duì)Sox2 和Nucleostemin 的檢測(cè)，Sox2 是Sox 基因家族的一員[6]，表達(dá)于胚胎干細(xì)胞，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用；Nucleoste?min[7]是表達(dá)于干細(xì)胞的干預(yù)腫瘤細(xì)胞增殖的P53結(jié)合蛋白。我們的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)綠原酸干預(yù)后，上述腫瘤干性相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，雖然兩者基因的表達(dá)下降不能明確表明腫瘤干細(xì)胞的存在減少，但可證明綠原酸降低了MG63 細(xì)胞產(chǎn)生具有腫瘤干細(xì)胞特性細(xì)胞群的能力。

腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且參與遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究表明，腫瘤細(xì)胞的遷移過(guò)程可以視為腫瘤細(xì)胞對(duì)于人體微環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程[8]。而腫瘤細(xì)胞的侵襲，既可以通過(guò)穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜游走至血管內(nèi)；又可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞相黏附，并穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞游走至血管外[9-10]。腫瘤細(xì)胞如若侵襲性增強(qiáng)會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的傷害，與此同時(shí)，腫瘤細(xì)胞凋亡的減少會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖[11]，對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生不良影響。

我們的研究表明綠原酸不僅可以通過(guò)降低遷移速率，致使MG63 細(xì)胞株無(wú)法適應(yīng)人體微環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞易被機(jī)體清除，還能夠通過(guò)抑制MG63 細(xì)胞株的遷移性及侵襲性，抑制腫瘤細(xì)胞的全身擴(kuò)散。此外，實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的Bcl-2和Bax 基因均是Bcl-2 家族成員，在腫瘤細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[12-13]。抗凋亡基因Bcl-2 經(jīng)綠原酸干預(yù)后表達(dá)下降，而Bax的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，用凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例，發(fā)現(xiàn)經(jīng)綠原酸處理后的細(xì)胞凋亡比例上升，此結(jié)果證實(shí)綠原酸促進(jìn)了骨肉瘤MG63 細(xì)胞的凋亡。

在后續(xù)研究中，我們將檢測(cè)更多凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，并對(duì)各細(xì)胞系的骨肉瘤細(xì)胞，如HOS、Saos 等進(jìn)行研究[14]，更精確全面地闡明綠原酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)相關(guān)的凋亡機(jī)制也應(yīng)做進(jìn)一步探索，以期為臨床治療骨肉瘤，開發(fā)新的藥物提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，綠原酸可以降低MG63 細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞干性，抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63 的增殖、侵襲和遷移，并且促進(jìn)MG63 骨肉瘤細(xì)胞凋亡。這對(duì)骨肉瘤的疾病進(jìn)程以及治療有重要意義，未來(lái)有望成為治療骨肉瘤的有效藥物。