李淞漪 吳迪 倪笑玲 李鼎恒 李迎華

卵巢是女性生殖器官好發(fā)腫瘤的器官，卵巢的良性腫瘤占女性生殖器良性腫瘤的1/4～1/3，可發(fā)生于任何年齡，但多見于生育年齡婦女。卵巢腫瘤的組織學(xué)類型極為復(fù)雜，部分良性腫瘤可發(fā)生惡變，可轉(zhuǎn)化為卵巢癌或其他惡性度較高的腫瘤，給該病的根治帶來困難。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomere enzyme reverse transcriptase，hTERT）是人端粒酶的核心亞基，在人類癌癥中起重要作用[1]。hTERT的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖、凋亡抑制、衰老逃逸和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。對(duì)hTERT調(diào)控機(jī)制的深入了解是探討腫瘤發(fā)病機(jī)制和尋找診治方法的關(guān)鍵。研究證實(shí)包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤與hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化相關(guān)[2-5]，目前檢測(cè)hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化是多種惡性腫瘤相關(guān)的研究熱點(diǎn)。本研究通過檢測(cè)卵巢良、惡性腫瘤組織中hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化的差異，探討卵巢癌發(fā)病機(jī)制與hTERT啟動(dòng)子甲基化的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 收集2017年1月至2019年2月在本院手術(shù)治療的15例卵巢惡性腫瘤患者術(shù)中新鮮腫瘤組織標(biāo)本，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；另取同期15例卵巢良性腫瘤患者術(shù)中新鮮腫瘤組織標(biāo)本，設(shè)為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)手術(shù)治療的卵巢腫瘤患者，術(shù)后病理檢查確診為卵巢良性贅生性腫瘤或卵巢惡性腫瘤；（2）入組患者術(shù)前均未接受任何治療（如化療、激素治療等）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）卵巢非贅生性腫瘤（如黃體囊腫、黃素化囊腫、卵巢血腫等）患者；（2）妊娠期婦女；（3）合并2種及以上原發(fā)惡性腫瘤患者。實(shí)驗(yàn)組患者年齡32～68歲，中位年齡45歲；病理類型：上皮性惡性腫瘤13例，未成熟性畸胎瘤2例；手術(shù)病理分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期5例，Ⅲ期3例。對(duì)照組患者年齡32～68歲，中位年齡43歲；行卵巢囊腫剝除術(shù)12例，行一側(cè)附件切除術(shù)3例；病理類型：卵巢漿液性囊腺瘤8例，黏液性囊腺瘤3例，成熟性畸胎瘤4例；腫瘤分布：?jiǎn)蝹?cè)卵巢12例，雙側(cè)卵巢3例；腫瘤直徑：＜10cm 13例，≥10cm 2例。兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞標(biāo)本 根據(jù)文獻(xiàn)[6]，hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化在宮頸癌細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，故培養(yǎng)Hela細(xì)胞3組，作為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.3 主要試劑 細(xì)胞/組織基因組 DNA提取試劑盒（GK0221）購(gòu)自上海捷瑞生物科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)試劑（PCR SuperMix I）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Hela細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 依照DNA提取試劑盒說明書對(duì)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組標(biāo)本及Hela細(xì)胞提取DNA，對(duì)提取的DNA按EpiTect Bisulfite kit（Cat.no-59104）提供的說明書進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C變性5min，60°C溫育 25min，95°C 變性 5min，60°C 溫育 85min，95°C 變性5min，60°C 溫育 175min，降到 20°C 保存。再將純化的DNA洗脫下來。經(jīng)處理后，DNA中所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶（C）都轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶則不發(fā)生改變。然后進(jìn)行甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（methylation specific polymerase chain reaction，MSP）法檢測(cè)甲基化：通過methprimer平臺(tái)（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi），依據(jù)人類 hTERT基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 100～1 600bp范圍富含胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鳥嘌呤（G）（CpG 島）的序列，設(shè)計(jì)甲基化特異性引物（methylation specific primers，實(shí)驗(yàn)中用M表示）hTERT-MF/R：上游5′-GGAAGTGTTGTAGGGAGGTATTTC-3′，下游 5′-CTTTAACCGCTAACCTAATCCG-3′，擴(kuò)增目的基因片段198bp；設(shè)計(jì)非甲基化特異性引物（unmethylated specific primers，實(shí)驗(yàn)中用U表示）hTERT-UF/R：上游 5′-GGAAGTGTTGTAGGGAGGTATTTT-3′，下游：5′-CTTTAACCAC －TAACCTAATCCAAA-3′，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度198bp。應(yīng)用上述兩組引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3min；95°C 15s，60°C 30s，72°C 20s，該步驟循環(huán)40次；72°C 7min，降到12°C保存。然后進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 甲基化檢測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) MSP法檢測(cè)結(jié)果分析，如果甲基化特異性引物擴(kuò)增出條帶，非甲基化特異性引物未擴(kuò)增出條帶，說明hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島被檢測(cè)位點(diǎn)發(fā)生了甲基化；如果甲基化特異性引物未擴(kuò)增出條帶，非甲基化特異性引物擴(kuò)增出條帶，說明hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島被檢測(cè)位點(diǎn)未發(fā)生甲基化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組甲基化陽(yáng)性率為73.3%（11/15），對(duì)照組甲基化陽(yáng)性率為26.7%（4/15），陽(yáng)性對(duì)照組甲基化陽(yáng)性率為100.0%（3/3）。實(shí)驗(yàn)組甲基化陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027）。實(shí)驗(yàn)組甲基化陽(yáng)性標(biāo)本中，上皮性惡性腫瘤10例，未成熟性畸胎瘤1例；手術(shù)病理分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期4例，Ⅲ期2例。對(duì)照組甲基化陽(yáng)性標(biāo)本中，卵巢漿液性囊腺瘤2例，黏液性囊腺瘤1例，成熟性畸胎瘤1例。MSP結(jié)果見圖1。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，卵巢腫瘤組織中存在高頻率的端粒融合，但是在正常的鄰近組織或良性卵巢組織中發(fā)現(xiàn)了有限的端粒融合[7]。端粒融合可通過融合點(diǎn)兩側(cè)端粒酶外顯子表達(dá)的改變影響hTERT功能[8]。hTERT為端粒酶的催化蛋白亞單位，與端粒酶有平行關(guān)系，為其限速因素，hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)被認(rèn)為在人類癌癥中的端粒酶活化中起主要作用[9]。CpG啟動(dòng)子甲基化是hTERT多種調(diào)節(jié)途徑之一[10]。hTERT CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，hTERT復(fù)合物在約80%～90%的惡性腫瘤中具有活性，并受各種因素調(diào)節(jié)，包括hTERT基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)[11-13]。外周血白細(xì)胞中hTERT啟動(dòng)子的高甲基化可作為頭頸癌進(jìn)展的分子標(biāo)志物[14]。上述結(jié)論與本研究中惡性卵巢腫瘤組織中hTERT啟動(dòng)子的高甲基化具有一致性。本研究通過檢測(cè)卵巢良、惡性卵巢腫瘤組織中hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化率的差異，結(jié)果顯示惡性卵巢腫瘤組織hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化率達(dá)73.3%，高于卵巢良性腫瘤組織的26.7%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究提示hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化與卵巢惡性腫瘤有相關(guān)性。

圖1 3組實(shí)驗(yàn)標(biāo)本hTERT啟動(dòng)子MSP電泳圖（a：陽(yáng)性對(duì)照組3例均可見M條帶；b-c：對(duì)照組15例中4例可見M條帶；d-e：實(shí)驗(yàn)組15例中11例可見M條帶。M：甲基化引物擴(kuò)增的條帶；U：非甲基化引物擴(kuò)增的條帶）

關(guān)于hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者做了大量的研究。在癌癥進(jìn)展過程中，沿著基因體的CpG位點(diǎn)存在全基因組的低甲基化，在基因啟動(dòng)子區(qū)域存在CpG島的高甲基化[15]。hTERT是啟動(dòng)子序列甲基化與基因表達(dá)呈正相關(guān)的基因，hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化與hTERT mRNA和端粒酶活性之間的相關(guān)性表明hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化可能與hTERT調(diào)控有關(guān)[16]。研究表明hTERT啟動(dòng)子內(nèi)特定區(qū)域的甲基化，特別是hTERT核心啟動(dòng)子上游的甲基化，與基因激活有關(guān)[17]。李紅霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)，hTERT激活與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。反義hTERT基因治療能通過抑制端粒酶活性、增強(qiáng)細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。核心啟動(dòng)子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近由100個(gè)左右核苷酸所構(gòu)成的功能區(qū)域。本研究采用hTERT核心啟動(dòng)子上游位置的甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增，該目標(biāo)基因片段表達(dá)陽(yáng)性的病例說明存在核心啟動(dòng)子上游的甲基化，根據(jù)上游啟動(dòng)子甲基化可引起端粒酶活化這一特點(diǎn)，說明卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展可能因hTERT核心啟動(dòng)子上游的甲基化引起該基因的活化進(jìn)而引起卵巢癌的進(jìn)展。關(guān)于hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化如何導(dǎo)致hTERT活化有以下幾種解釋：（1）可能是基于因DNA甲基化而阻礙抑制性元件結(jié)合。結(jié)合因子（CCCTC binding factor，CTCF）與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)合并抑制hTERT轉(zhuǎn)錄，但DNA甲基化阻止CTCF結(jié)合，從而允許端粒酶的激活[20]。（2）Wilms腫瘤蛋白是hTERT表達(dá)的抑制因子，其結(jié)合位點(diǎn)在癌癥中表現(xiàn)出CpG甲基化的增加，導(dǎo)致抑制效應(yīng)的阻斷，從而導(dǎo)致 hTERT 的表達(dá)[16，21]。（3）DNA 甲基化可通過影響DNA暴露于轉(zhuǎn)錄因子而影響基因表達(dá)的染色質(zhì)構(gòu)象變化[22]，可能導(dǎo)致與不同因子結(jié)合，這些因子可以驅(qū)動(dòng)hTERT在癌癥中的表達(dá)[23]。對(duì)于卵巢癌hTERT核心啟動(dòng)子上游序列甲基化引起端粒酶活化的機(jī)制需針對(duì)后續(xù)卵巢惡性腫瘤組織啟動(dòng)子區(qū)的基因測(cè)序等研究來進(jìn)一步探討。

本研究顯示卵巢惡性腫瘤組織中hTERT啟動(dòng)子DNA甲基化較卵巢良性腫瘤組織偏高，作為篩查卵巢惡性腫瘤的檢測(cè)指標(biāo)具較高的特異度，其特異度與引物的位點(diǎn)有關(guān)系，根據(jù)其他學(xué)者的研究結(jié)論，hTERT啟動(dòng)子上游部位具有更高頻的甲基化。本研究?jī)H采用一個(gè)位點(diǎn)的引物進(jìn)行甲基化擴(kuò)增驗(yàn)證，雖然在惡性卵巢腫瘤組織檢測(cè)到了hTERT啟動(dòng)子的高甲基化的情況，但在少部分良性腫瘤，也檢測(cè)到了hTERT甲基化的陽(yáng)性表達(dá)，故不能對(duì)比其他位置甲基化引物的擴(kuò)增是否具有更高的特異性和不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，另外本研究實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組例數(shù)偏少，具有局限性，不同位點(diǎn)引物實(shí)驗(yàn)的甲基化差異需后續(xù)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。后續(xù)需擴(kuò)大樣本量和取多個(gè)區(qū)段引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選特異度和靈敏度更高的基因位點(diǎn)，并進(jìn)一步研究甲基化與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，并為游離血檢測(cè)早期卵巢惡性腫瘤提供組織學(xué)依據(jù)。