李淞漪 吳迪 倪笑玲 李鼎恒 李迎華

卵巢是女性生殖器官好發(fā)腫瘤的器官，卵巢的良性腫瘤占女性生殖器良性腫瘤的1/4～1/3，可發(fā)生于任何年齡，但多見于生育年齡婦女。卵巢腫瘤的組織學(xué)類型極為復(fù)雜，部分良性腫瘤可發(fā)生惡變，可轉(zhuǎn)化為卵巢癌或其他惡性度較高的腫瘤，給該病的根治帶來困難。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomere enzyme reverse transcriptase，hTERT）是人端粒酶的核心亞基，在人類癌癥中起重要作用[1]。hTERT的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖、凋亡抑制、衰老逃逸和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。對hTERT調(diào)控機制的深入了解是探討腫瘤發(fā)病機制和尋找診治方法的關(guān)鍵。研究證實包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤與hTERT啟動子DNA甲基化相關(guān)[2-5]，目前檢測hTERT啟動子DNA甲基化是多種惡性腫瘤相關(guān)的研究熱點。本研究通過檢測卵巢良、惡性腫瘤組織中hTERT啟動子DNA甲基化的差異，探討卵巢癌發(fā)病機制與hTERT啟動子甲基化的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 收集2017年1月至2019年2月在本院手術(shù)治療的15例卵巢惡性腫瘤患者術(shù)中新鮮腫瘤組織標(biāo)本，設(shè)為實驗組；另取同期15例卵巢良性腫瘤患者術(shù)中新鮮腫瘤組織標(biāo)本，設(shè)為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)手術(shù)治療的卵巢腫瘤患者，術(shù)后病理檢查確診為卵巢良性贅生性腫瘤或卵巢惡性腫瘤；（2）入組患者術(shù)前均未接受任何治療（如化療、激素治療等）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）卵巢非贅生性腫瘤（如黃體囊腫、黃素化囊腫、卵巢血腫等）患者；（2）妊娠期婦女；（3）合并2種及以上原發(fā)惡性腫瘤患者。實驗組患者年齡32～68歲，中位年齡45歲；病理類型：上皮性惡性腫瘤13例，未成熟性畸胎瘤2例；手術(shù)病理分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期5例，Ⅲ期3例。對照組患者年齡32～68歲，中位年齡43歲；行卵巢囊腫剝除術(shù)12例，行一側(cè)附件切除術(shù)3例；病理類型：卵巢漿液性囊腺瘤8例，黏液性囊腺瘤3例，成熟性畸胎瘤4例；腫瘤分布：單側(cè)卵巢12例，雙側(cè)卵巢3例；腫瘤直徑：＜10cm 13例，≥10cm 2例。兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞標(biāo)本 根據(jù)文獻(xiàn)[6]，hTERT啟動子DNA甲基化在宮頸癌細(xì)胞陽性表達(dá)，故培養(yǎng)Hela細(xì)胞3組，作為陽性對照組。

1.3 主要試劑 細(xì)胞/組織基因組 DNA提取試劑盒（GK0221）購自上海捷瑞生物科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測試劑（PCR SuperMix I）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Hela細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.4 實驗方法 依照DNA提取試劑盒說明書對實驗組、對照組標(biāo)本及Hela細(xì)胞提取DNA，對提取的DNA按EpiTect Bisulfite kit（Cat.no-59104）提供的說明書進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，反應(yīng)程序為：95°C變性5min，60°C溫育 25min，95°C 變性 5min，60°C 溫育 85min，95°C 變性5min，60°C 溫育 175min，降到 20°C 保存。再將純化的DNA洗脫下來。經(jīng)處理后，DNA中所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶（C）都轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶則不發(fā)生改變。然后進(jìn)行甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（methylation specific polymerase chain reaction，MSP）法檢測甲基化：通過methprimer平臺（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi），依據(jù)人類 hTERT基因的啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 100～1 600bp范圍富含胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鳥嘌呤（G）（CpG 島）的序列，設(shè)計甲基化特異性引物（methylation specific primers，實驗中用M表示）hTERT-MF/R：上游5′-GGAAGTGTTGTAGGGAGGTATTTC-3′，下游 5′-CTTTAACCGCTAACCTAATCCG-3′，擴增目的基因片段198bp；設(shè)計非甲基化特異性引物（unmethylated specific primers，實驗中用U表示）hTERT-UF/R：上游 5′-GGAAGTGTTGTAGGGAGGTATTTT-3′，下游：5′-CTTTAACCAC －TAACCTAATCCAAA-3′，擴增目的基因片段長度198bp。應(yīng)用上述兩組引物組合進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)程序為：95°C 3min；95°C 15s，60°C 30s，72°C 20s，該步驟循環(huán)40次；72°C 7min，降到12°C保存。然后進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 甲基化檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) MSP法檢測結(jié)果分析，如果甲基化特異性引物擴增出條帶，非甲基化特異性引物未擴增出條帶，說明hTERT基因啟動子區(qū)CpG島被檢測位點發(fā)生了甲基化；如果甲基化特異性引物未擴增出條帶，非甲基化特異性引物擴增出條帶，說明hTERT基因啟動子區(qū)CpG島被檢測位點未發(fā)生甲基化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實驗組甲基化陽性率為73.3%（11/15），對照組甲基化陽性率為26.7%（4/15），陽性對照組甲基化陽性率為100.0%（3/3）。實驗組甲基化陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027）。實驗組甲基化陽性標(biāo)本中，上皮性惡性腫瘤10例，未成熟性畸胎瘤1例；手術(shù)病理分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期4例，Ⅲ期2例。對照組甲基化陽性標(biāo)本中，卵巢漿液性囊腺瘤2例，黏液性囊腺瘤1例，成熟性畸胎瘤1例。MSP結(jié)果見圖1。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，卵巢腫瘤組織中存在高頻率的端粒融合，但是在正常的鄰近組織或良性卵巢組織中發(fā)現(xiàn)了有限的端粒融合[7]。端粒融合可通過融合點兩側(cè)端粒酶外顯子表達(dá)的改變影響hTERT功能[8]。hTERT為端粒酶的催化蛋白亞單位，與端粒酶有平行關(guān)系，為其限速因素，hTERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)被認(rèn)為在人類癌癥中的端粒酶活化中起主要作用[9]。CpG啟動子甲基化是hTERT多種調(diào)節(jié)途徑之一[10]。hTERT CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，hTERT復(fù)合物在約80%～90%的惡性腫瘤中具有活性，并受各種因素調(diào)節(jié)，包括hTERT基因啟動子的甲基化狀態(tài)[11-13]。外周血白細(xì)胞中hTERT啟動子的高甲基化可作為頭頸癌進(jìn)展的分子標(biāo)志物[14]。上述結(jié)論與本研究中惡性卵巢腫瘤組織中hTERT啟動子的高甲基化具有一致性。本研究通過檢測卵巢良、惡性卵巢腫瘤組織中hTERT啟動子DNA甲基化率的差異，結(jié)果顯示惡性卵巢腫瘤組織hTERT啟動子DNA甲基化率達(dá)73.3%，高于卵巢良性腫瘤組織的26.7%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究提示hTERT啟動子DNA甲基化與卵巢惡性腫瘤有相關(guān)性。

圖1 3組實驗標(biāo)本hTERT啟動子MSP電泳圖（a：陽性對照組3例均可見M條帶；b-c：對照組15例中4例可見M條帶；d-e：實驗組15例中11例可見M條帶。M：甲基化引物擴增的條帶；U：非甲基化引物擴增的條帶）

關(guān)于hTERT啟動子DNA甲基化與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機制，國內(nèi)外已有學(xué)者做了大量的研究。在癌癥進(jìn)展過程中，沿著基因體的CpG位點存在全基因組的低甲基化，在基因啟動子區(qū)域存在CpG島的高甲基化[15]。hTERT是啟動子序列甲基化與基因表達(dá)呈正相關(guān)的基因，hTERT啟動子DNA甲基化與hTERT mRNA和端粒酶活性之間的相關(guān)性表明hTERT啟動子DNA甲基化可能與hTERT調(diào)控有關(guān)[16]。研究表明hTERT啟動子內(nèi)特定區(qū)域的甲基化，特別是hTERT核心啟動子上游的甲基化，與基因激活有關(guān)[17]。李紅霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)，hTERT激活與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。反義hTERT基因治療能通過抑制端粒酶活性、增強細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑抑制卵巢癌細(xì)胞生長[19]。核心啟動子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點附近由100個左右核苷酸所構(gòu)成的功能區(qū)域。本研究采用hTERT核心啟動子上游位置的甲基化引物進(jìn)行擴增，該目標(biāo)基因片段表達(dá)陽性的病例說明存在核心啟動子上游的甲基化，根據(jù)上游啟動子甲基化可引起端粒酶活化這一特點，說明卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展可能因hTERT核心啟動子上游的甲基化引起該基因的活化進(jìn)而引起卵巢癌的進(jìn)展。關(guān)于hTERT啟動子DNA甲基化如何導(dǎo)致hTERT活化有以下幾種解釋：（1）可能是基于因DNA甲基化而阻礙抑制性元件結(jié)合。結(jié)合因子（CCCTC binding factor，CTCF）與轉(zhuǎn)錄起始位點結(jié)合并抑制hTERT轉(zhuǎn)錄，但DNA甲基化阻止CTCF結(jié)合，從而允許端粒酶的激活[20]。（2）Wilms腫瘤蛋白是hTERT表達(dá)的抑制因子，其結(jié)合位點在癌癥中表現(xiàn)出CpG甲基化的增加，導(dǎo)致抑制效應(yīng)的阻斷，從而導(dǎo)致 hTERT 的表達(dá)[16，21]。（3）DNA 甲基化可通過影響DNA暴露于轉(zhuǎn)錄因子而影響基因表達(dá)的染色質(zhì)構(gòu)象變化[22]，可能導(dǎo)致與不同因子結(jié)合，這些因子可以驅(qū)動hTERT在癌癥中的表達(dá)[23]。對于卵巢癌hTERT核心啟動子上游序列甲基化引起端粒酶活化的機制需針對后續(xù)卵巢惡性腫瘤組織啟動子區(qū)的基因測序等研究來進(jìn)一步探討。

本研究顯示卵巢惡性腫瘤組織中hTERT啟動子DNA甲基化較卵巢良性腫瘤組織偏高，作為篩查卵巢惡性腫瘤的檢測指標(biāo)具較高的特異度，其特異度與引物的位點有關(guān)系，根據(jù)其他學(xué)者的研究結(jié)論，hTERT啟動子上游部位具有更高頻的甲基化。本研究僅采用一個位點的引物進(jìn)行甲基化擴增驗證，雖然在惡性卵巢腫瘤組織檢測到了hTERT啟動子的高甲基化的情況，但在少部分良性腫瘤，也檢測到了hTERT甲基化的陽性表達(dá)，故不能對比其他位置甲基化引物的擴增是否具有更高的特異性和不同的實驗結(jié)果，另外本研究實驗組及對照組例數(shù)偏少，具有局限性，不同位點引物實驗的甲基化差異需后續(xù)實驗來進(jìn)一步證實。后續(xù)需擴大樣本量和取多個區(qū)段引物進(jìn)行實驗篩選特異度和靈敏度更高的基因位點，并進(jìn)一步研究甲基化與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，并為游離血檢測早期卵巢惡性腫瘤提供組織學(xué)依據(jù)。