葉松道 葉宣梅 王曉歐 林巍

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染而導(dǎo)致的傳染性疾病，我國HCV感染者約有1 476.5萬，居全球首位[1]。HCV感染后不能及時清除而發(fā)展為慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC），是肝硬化、肝細(xì)胞癌的主要致病原因之一，因此對丙型肝炎慢性化機制的研究以及如何預(yù)測并提高干擾素（IFN）治療應(yīng)答率仍然是目前關(guān)注的熱點[2]。巨噬細(xì)胞抑制因子-1（macrophage inhibitory cytokine-1，MIC-1）又稱生長分化因子-15，是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的成員之一。研究表明，MIC-1在健康人體內(nèi)低表達(dá)，但在炎癥與外傷等病理或應(yīng)激作用下表達(dá)上調(diào)[3]。近來有研究發(fā)現(xiàn)MIC-1在慢性乙型肝炎、肝硬化及小細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)升高[4]。本研究通過測定CHC患者血漿MIC-1水平，探討其與CHC患者體內(nèi)病毒載量、肝臟損害程度及PR方案[聚乙二醇干擾素 α（Peg IFN-α）+利巴韋林（RBV）]抗病毒療效的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年9月至2018年8月在本院感染內(nèi)科就診的CHC患者57例，男32例，女25例；年齡10～76（39.26±9.22）歲。所有患者均符合《丙型肝炎防治指南（2015年更新版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，艾滋病毒（HIV）抗體陰性，能接受PR治療方案，即Peg IFN-α聯(lián)合RBV治療。排除合并慢性乙型肝炎等其他病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝炎等其他肝病患者。選取本院健康體檢者26例作為對照組，男 15 例，女 11 例；年齡 13～74（38.55±10.06）歲。所有健康體檢者均無肝腎疾病、血液病、自身免疫性疾病和心腦血管疾病，肝功能正常，經(jīng)檢測排除甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒和巨細(xì)胞病毒等感染，HIV抗體陰性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有研究對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 治療方法與療效判斷 所有患者就診后均應(yīng)用PR 治療方案，用法：Peg IFN-α-2a皮下注射，180μg/次，1周/次；RBV口服，800～1 000mg/d，基本療程為 48 周。治療前及治療 4、12、24、48周監(jiān)測HCV RNA，評估病毒應(yīng)答情況并據(jù)此調(diào)整劑量。療效判斷[5]：（1）快速應(yīng)答（RVR）：治療第4周HCV RNA不可測；（2）早期應(yīng)答：治療第12周HCV RNA較治療前下降＞2Log；（3）部分應(yīng)答：治療第12周HCV RNA較治療前下降＞2Log，且第12周和第24周HCV RNA可測；（4）延遲應(yīng)答：治療第12周HCV RNA較治療前下降＞2Log，但仍可測，第24周HCV RNA不可測；（5）無應(yīng)答：治療第12周 HCV RNA較治療前下降＜2Log；（6）持續(xù)應(yīng)答：治療結(jié)束后第12周和第24周HCV RNA不可測。根據(jù)療效將CHC患者分為應(yīng)答組（包括快速應(yīng)答、早期應(yīng)答、部分應(yīng)答、延遲應(yīng)答和持續(xù)應(yīng)答）和無應(yīng)答組。

1.2.2 標(biāo)本采集 所有患者于就診后次日早晨空腹采集靜脈血3～4ml，置于EDTA-K2抗凝管中并立刻上下顛倒混勻10次，3 000rpm離心5min，及時分離血漿于-40℃保存，用來檢測血漿MIC-1、HCV RNA、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、四型膠原（C-Ⅳ）等指標(biāo)，采集標(biāo)本之前均未進(jìn)行抗病毒治療，未使用免疫調(diào)節(jié)劑。基本療程結(jié)束（48周）后再次采集靜脈血，檢測MIC-1水平。

1.2.3 血漿MIC-1水平測定 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，嚴(yán)格按照試劑盒（蘇州晶美生物科技有限公司）說明書進(jìn)行操作，采用Anthos 2010型酶標(biāo)儀（上海博賽思科技有限公司）檢測樣本及標(biāo)準(zhǔn)品光密度（OD）值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求待測樣本MIC-1水平。個別樣本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，用樣本稀釋液適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

1.2.4 血漿ALT活性測定 采用速率法，在Siemens ADVIA2400全自動生化分析儀（美國西門子公司）上完成檢測，采用原裝試劑及校準(zhǔn)品，正常參考范圍為10～49U/L。

1.2.5 血漿C-Ⅳ水平測定 采用化學(xué)發(fā)光免疫分析，在MAGLUMI 2000全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（深圳新產(chǎn)業(yè)生物有限公司）上完成檢測，采用原裝試劑及校準(zhǔn)品，正常參考范圍為5.0～30.0ng/ml。

1.2.6 HCV RNA定量分析 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，試劑盒購自深圳匹基生物工程公司，在ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）上完成檢測，以HCV RNA≥5.0×102拷貝/ml為異常。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間和組內(nèi)比較均采用Mann-Whitney U檢驗。CHC患者血漿MIC-1水平與ALT活性、C-Ⅳ水平及HCV RNA水平的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHC患者治療前血漿MIC-1水平與對照組比較 治療前CHC患者血漿MIC-1水平為369.84（193.51，830.62）pg/ml，明顯高于對照組的 258.77（138.03，441.12）pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.801，P＜0.05）。

2.2 CHC患者不同ALT水平、C-Ⅳ活性及HCV RNA水平組血漿MIC-1水平比較 根據(jù)血漿ALT活性將CHC患者分為ALT升高組（＞49U/L）29例和ALT正常組（10～49U/L）28例，ALT升高組血漿 MIC-1水平高于ALT正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)血漿C-Ⅳ水平將CHC患者分為C-Ⅳ升高組（＞30ng/ml）和C-Ⅳ正常組（5.0～30.0ng/ml），C-Ⅳ升高組血漿 MIC-1 水平高于C-Ⅳ正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)血漿HCV RNA水平將CHC患者分為HCV RNA低水平組（＜2×106拷貝/ml）和 HCV RNA 高水平組（≥2×106拷貝/ml），HCV RNA高水平組血漿MIC-1水平高于HCV RNA低水平組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 CHC患者不同ALT水平、C-Ⅳ活性及HCV RNA水平組血漿MIC-1水平比較（pg/ml）

2.3 CHC患者血漿MIC-1水平與ALT活性、C-Ⅳ水平及HCV RNA水平的相關(guān)性分析 CHC患者血漿MIC-1水平與ALT活性、C-Ⅳ水平及HCV RNA水平均呈正相關(guān)（r=0.322、0.423和 0.333，均 P＜0.05）。

2.4 CHC患者血漿MIC-1水平與PR方案療效的關(guān)系57例CHC患者中，有7例患者治療后無法隨訪。隨訪的50例患者中，應(yīng)答組37例，無應(yīng)答組13例。兩組患者治療前后血漿MIC-1水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；應(yīng)答組治療后血漿MIC-1水平低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），無應(yīng)答組治療前后血漿MIC-1水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 CHC患者不同療效組血漿MIC-1水平比較（pg/ml）

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV的感染率約為2.8%[6]，其中20%～30%的感染者可自發(fā)清除病毒，而70%～80%的感染者會呈持續(xù)感染，約30%的CHC最終發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞癌。丙型肝炎肝損害的主要原因是HCV感染后引起的免疫學(xué)應(yīng)答，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞起重要作用[7]。丙型肝炎慢性化機制還尚未闡明，一般認(rèn)為是宿主免疫、遺傳易感性和病毒共同作用的結(jié)果。

MIC-1最早由Bootcov等[8]在1997年從活化的巨噬細(xì)胞系克隆發(fā)現(xiàn)，主要參與器官生長、分化與發(fā)育。研究表明，MIC-1通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡途徑參與了多個器官的損傷和多種疾病的進(jìn)展，比如心血管疾病[9]、惡性腫瘤[10]和糖尿病[11]等。Hsiao 等[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)肝臟損傷時，MIC-1水平明顯上升。盧鶯燕等[4]研究了MIC-1在慢性乙型肝炎和肝硬化中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎與肝硬化組患者血清MIC-1水平均明顯增高，肝硬化組肝組織中MIC-1的表達(dá)明顯高于慢性乙型肝炎組，且MIC-1水平與肝硬化程度呈正相關(guān)。Si等[13]在研究MIC-1與HCV復(fù)制的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，MIC-1可通過改變宿主肝細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和生長促進(jìn)HCV的復(fù)制，并與HCV所致的原發(fā)性肝癌密切相關(guān)。張建等[14]發(fā)現(xiàn)CHC患者血清MIC-1水平與心臟左房內(nèi)徑、左室后壁厚度呈正相關(guān)，與射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，檢測MIC-1有助于評估患者心血管損害。

本研究顯示，CHC患者血漿MIC-1水平明顯高于正常人群，而且血漿MIC-1水平與患者HCV RNA載量、血漿ALT活性及C-Ⅳ水平均呈正相關(guān)。血清ALT活性在一定程度上可以反映患者肝細(xì)胞的損傷程度及病情嚴(yán)重程度，血漿C-Ⅳ水平與肝臟纖維化程度的密切相關(guān)，是反映肝纖維化較為特異和靈敏的指標(biāo)，高靈敏度的HCV-RNA定量檢測不僅是判斷HCV感染的主要依據(jù)，也是丙型肝炎患者IFN療效觀察的重要參數(shù)[15]。研究結(jié)果表明，MIC-1可能參與了HCV的復(fù)制、肝細(xì)胞的損傷及肝纖維化過程，升高的血漿MIC-1水平或可作為HCV感染的潛在診斷標(biāo)志物。然而，MIC-1在HCV感染中的具體作用機制并不明確，尚需更多的研究來證實。目前PR方案仍然是我國治療CHC的重要手段[5]，與療效有關(guān)的因素包括病毒因素（病毒載量、病毒基因型等）[16-17]和宿主因素（年齡、性別、種族、肝臟組織學(xué)及機體免疫狀態(tài)等）[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)答組治療后血漿MIC-1水平明顯下降，而無應(yīng)答組治療前后血漿MIC-1水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示血漿MIC-1水平或可作為PR方案療效的標(biāo)志。然而，應(yīng)答組與無應(yīng)答組患者在治療前血漿MIC-1水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明血漿MIC-1水平對PR方案治療效果的預(yù)測沒有顯著意義。

總之，血漿MIC-1水平和CHC患者體內(nèi)病毒載量、臨床病情有著較為密切的關(guān)系，其水平測定或可作為體內(nèi)HCV病毒載量、肝臟損害程度及PR方案抗病毒療效的評價指標(biāo)，但治療前尚不能對PR方案療效進(jìn)行預(yù)測。