黃曉軍 陳茜圓 任卓超 金興

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性彌漫性肺損傷和進而發(fā)生的急性呼吸衰竭。ALI是嚴重創(chuàng)傷、大面積燒傷和嚴重感染等患者死亡的主要原因之一，因此，對其防治具有重要的臨床意義。盡管已作了大量的實驗與臨床研究，但ALI的發(fā)病機制仍未完全闡明，且迄今尚無安全而有效的治療藥物，目前常以小潮氣量保護性機械通氣來降低其死亡率。近年來，研究表明氧化應(yīng)激狀態(tài)在ALI發(fā)病及損傷機制中發(fā)揮著重要作用[1-3]。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是多酚類化合物，主要來源于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物，具有抗氧化、抗自由基作用[4-5]。RES是否可應(yīng)用于ALI的治療，目前研究很少，對此本研究進行了ALI動物模型實驗，并對其作用機制作了探討。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（A044）購自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（KGT0 0100-1）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（KGEMC102a）及白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（KGEMC004）試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Gem Premier 3000血氣分析儀購自美國GE公司；IX51光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；凝膠成像分析系統(tǒng)（SYNGENE G:BOXChemiXR5）購自美國Bio-Rad公司；RES和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）購自美國Sigma公司。

1.2 實驗動物分組及模型制作 選取6～8周健康清潔級（Ⅱ級）雄性小鼠30只（由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供），采用隨機數(shù)字表法分為對照組（C組）、ALI組和RES干預(yù)組（RES組）3組，每組10只。RES組給予 RES（50mg/kg體重）灌胃，1次/d，連續(xù) 3d。第 4天時，RES組和ALI組腹腔注射LPS 10mg/kg（溶于400μl 0.9%氯化鈉注射液）制備內(nèi)毒素誘發(fā)ALI模型，C組腹腔注射同等容量的0.9%氯化鈉注射液。6h后配制10%水合氯醛腹腔注射麻醉，再由腹主動脈取血，行血氣分析，計算氧合指數(shù)（血氧分壓/吸入氧濃度），以氧合指數(shù)≤300mmHg為ALI模型制備成功的標準[6]。同時下腔靜脈取血肝素抗凝，然后處死小鼠，立即從胸腔中取出心肺組織。

1.3 肺組織勻漿收集 取左肺組織，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿，制備為10%組織勻漿。取0.45ml勻漿用于測定MPO；剩余勻漿用低溫離心機10 000r/min離心10min，收集上清液置于-80℃保存，以備下述檢測使用。

1.4 肺組織病理學(xué)觀察 取右肺副葉肺組織，0.9%氯化鈉溶液浸洗后，10%甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水置換，二甲苯透明后，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，Olympus IX51光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)結(jié)果，參照文獻[7]介紹的方法進行肺組織病理學(xué)損傷評分。每張切片隨機選取10個視野進行評分，取其平均值。

1.5 血清TNF-α和IL-6水平檢測 按照測試盒說明書，采用ELISA法檢測血清促炎因子TNF-α和IL-6水平。

1.6 肺組織MPO、SOD含量檢測 按照測試盒說明書，采用比色法檢測肺組織MPO、SOD含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，3組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織形態(tài)學(xué)變化 ALI組肺組織切片HE染色后，光鏡下可見炎癥反應(yīng)，中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤肺泡間隔、肺泡腔，肺泡腔不規(guī)則擴大、肺泡間隔斷裂（圖1）；RES組上述表現(xiàn)明顯減輕（圖2）；而C組未見上述反應(yīng)（圖3）。C組、ALI組和RES組肺組織病理學(xué)損傷評分分別為（0.74±0.20）、（6.26±0.58）、（3.60±0.52）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=315，P＜0.05）。與 C 組比較，ALI組和RES組肺組織病理學(xué)損傷評分均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與ALI組比較，RES組肺組織病理學(xué)損傷評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 ALI組小鼠肺組織病理切片所見（HE染色，×200）

圖2 RES組小鼠肺組織病理切片所見（HE染色，×200）

圖3 C組小鼠肺組織病理切片所見（HE染色，×200）

2.2 3組小鼠血清TNF-α、IL-6水平和肺組織MPO、SOD含量比較 與C組比較，ALI組和RES組血清TNF-α、IL-6水平及肺組織MPO含量均升高，肺組織SOD含量均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與ALI組相比，RES組血清TNF-α、IL-6水平及肺組織MPO含量均降低，肺組織SOD含量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組小鼠血清IL-6、TNF-α水平和肺組織MPO、SOD含量比較

3 討論

近年研究表明，活性氧（ROS）引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)在ALI的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用[1-3]。過量存在的ROS可超出抗氧化系統(tǒng)的能力，導(dǎo)致氧化與抗氧化失衡，最終引起疾病的發(fā)生。在生理情況下ROS是通過細胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件（ARE）調(diào)控的相關(guān)解毒、抗氧化酶去除和降解的[8]。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）在驅(qū)動ARE調(diào)控基因中起重要作用[9-12]。Nrf2是合成內(nèi)生性抗氧化酶的最主要的調(diào)節(jié)器，其主要在代謝性器官、解毒器官以及與外界相通的器官中高表達，如肝、腎、肺和腸等[13-14]。正常生理狀態(tài)下，Nrf2定位于細胞質(zhì)，與胞質(zhì)接頭蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）形成復(fù)合物，使Nrf2的含量維持在較低水平。當機體存在氧化應(yīng)激反應(yīng)時，Nrf2磷酸化并從Keap1蛋白上解離出來，隨即活化轉(zhuǎn)位進入細胞核結(jié)合到ARE上，啟動其下游多個抗氧化基因及解毒酶等的轉(zhuǎn)錄翻譯，來對抗氧化應(yīng)激[15]。其中抗氧化蛋白酶類基因是這些保護性基因中非常重要的一類，如SOD是體內(nèi)最重要的氧自由基清除劑。

RES主要來源于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物，具有很強的抗氧化、抗自由基作用。已有研究發(fā)現(xiàn)RES在一些高氧化應(yīng)激疾病中的保護作用。Sebai等[16]研究發(fā)現(xiàn)RES能抵消LPS所導(dǎo)致的腎臟血流動力學(xué)改變，可減少脂質(zhì)過氧化物，增加SOD、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的活性，減少血漿和尿中一氧化氮水平。Zhang等[5]在RES對無機砷暴露所致肝損傷的保護作用的研究中發(fā)現(xiàn)，與三氧化二砷處理組比較，RES預(yù)處理組保護了抗氧化酶SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，抑制了三氧化二砷誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS的增加，降低了丙二醛（MDA，脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，可用于監(jiān)測氧化損傷的指標）。Wang等[17]在RES對慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠炎癥和氧化應(yīng)激的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，與COPD組比較，RES治療組肺部小氣道炎癥減輕，MDA、血清IL-6和IL-8水平降低，SOD活性增加。

本研究結(jié)果顯示，RES干預(yù)可使LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織抗氧化酶SOD升高，氧化應(yīng)激損傷指標MPO降低，肺損傷評分降低，同時使血清中炎癥指標TNF-α和IL-6水平降低，對ALI起到保護作用。

綜上所述，RES可通過抗氧化應(yīng)激及清除氧自由基相關(guān)物質(zhì)，從而對LPS誘發(fā)的ALI小鼠起到保護性干預(yù)作用。本實驗只簡單探討了RES在ALI中起到的保護作用，其具體的作用機制及是否具有激活Nrf2與Nrf2/ARE通路共同作用干預(yù)ALI的發(fā)生和發(fā)展有待進一步探討。